核酸：理化性質(zhì)、純化原則要求、提取方法介紹

核酸是分子生物學(xué)的基礎(chǔ)，而核酸提取是整個分子行業(yè)繞不過去的門檻，很多時候一份樣本的核酸提取的好壞直接決定了檢測結(jié)果的有效性。核酸分為脫氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA），其中RNA又可以根據(jù)功能的不同分為核糖體RNA(rRNA)，信使RNA（mRNA）和轉(zhuǎn)移RNA（tRNA）。DNA主要集中在細(xì)胞核內(nèi)，線粒體和葉綠體中，而RNA主要分布在細(xì)胞質(zhì)當(dāng)中。

核酸中因為嘌呤堿和嘧啶堿具有共軛雙鍵，所以核酸具有紫外吸收的特性，DNA鈉鹽的紫外吸收在260nm附近，其吸光率以A260表示，在230nm處于吸收低谷，因此可以使用紫外分光光度計對核酸進(jìn)行定量及定性測定。核酸為兩性電解質(zhì)，相當(dāng)于多元酸，可以使用中性或偏堿性的緩沖液使核酸解離成陰離子，置于電場中向陽極運(yùn)動，這就是電泳的原理。 核酸的化學(xué)性質(zhì)

①酸效應(yīng)：在強(qiáng)酸和高溫，核酸完全水解為堿基，核糖或脫氧核糖和磷酸。在濃度略稀的的無機(jī)酸中，最易水解的化學(xué)鍵被選擇性的斷裂，一般為連接嘌呤和核糖的糖苷鍵，從而產(chǎn)生脫嘌呤核酸。

②堿效應(yīng)

1． DNA：當(dāng)PH值超出生理范圍（pH7~8）時，對DNA結(jié)構(gòu)將產(chǎn)生更為微妙的影響。堿效應(yīng)使堿基的互變異構(gòu)態(tài)發(fā)生變化。這種變化影響到特定堿基間的氫鍵作用，結(jié)果導(dǎo)至DNA雙鏈的解離，稱為DNA的變性

2．RNA：PH較高時，同樣的變性發(fā)生在RNA的螺旋區(qū)域中，但通常被RNA的堿性水解所掩蓋。這是因為RNA存在的2`-OH參與到對磷酸脂鍵中磷酸分子的分子內(nèi)攻擊，從而導(dǎo)至RNA的斷裂。

③化學(xué)變性：一些化學(xué)物質(zhì)能夠使DNA/RNA在中性PH下變性。由堆積的疏水剪輯形成的核酸二級結(jié)構(gòu)在能量上的穩(wěn)定性被削弱，則核酸變性。

核酸的物理性質(zhì)

①黏性：DNA的高軸比等性質(zhì)使得其水溶液具有高黏性，很長的DNA分子又易于被機(jī)械力或超聲波損傷，同時黏度下降。

② 浮力密度：可根據(jù)DNA的密度對其進(jìn)行純化和分析。在高濃度分子質(zhì)量的鹽溶液（CsCl）中，DNA具有與溶液大致相同的密度，將溶液高速離心，則CsCl趨于沉降于底部，從而建立密度梯度，而DNA最終沉降于其浮力密度相應(yīng)的位置，形成狹帶，這種技術(shù)成為平衡密度梯度離心或等密度梯度離心。

③穩(wěn)定性：核酸的結(jié)構(gòu)相當(dāng)穩(wěn)定，其主要原因有1、堿基對間的氫鍵2、堿基的堆積作用3、環(huán)境中的陽離子。

核酸提取純化原則和要求

1、保證核酸一級結(jié)構(gòu)的完整性

2、排除其它分子的污染（如提取DNA時排除RNA的干擾）

3、核酸樣品中不應(yīng)存在對酶有抑制作用的有機(jī)溶劑和高濃度的金屬離子

4、盡可能降低蛋白質(zhì)、多糖和脂類等大分子物質(zhì)

核酸提取應(yīng)注意的問題

1.簡化步驟，縮短提取時間

2.減少化學(xué)因素對核酸的降解

3.減少物理因素對核酸的降解：機(jī)械剪切力和高溫

4.防止核酸的生物降解

提取類型

1、總RNA提取

總RNA中，75-85%為rRNA(主要是28S-26S/23S和18S/16S rRNA)，其余的由分子量大小和核苷酸序列各不相同的mRNA和小分子RNA如tRNA、5S rRNA、5.8S rRNA、miRNA、siRNA、小核RNA（small nuclear RNA，snRNA）及核仁小分子RNA（small nuceolar RNA，snoRNA）等組成。

2、miRNA提取

MicroRNAs (miRNAs)是小型的、高度保守的RNA分子，如小干擾RNAs (siRNAs)，通過與他們的堿基配對調(diào)節(jié)其同源mRNA的分子表達(dá)，以預(yù)防通過各種機(jī)制的表達(dá)。他們已成為進(jìn)行發(fā)育、細(xì)胞增殖、分化和細(xì)胞周期的重點監(jiān)管機(jī)構(gòu)。

3、基因組DNA提取

進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)和功能研究以及基因診斷，通常要求得到的片段長度不小于100～200kb。在DNA提取過程中應(yīng)盡量避免使DNA斷裂和降解的各種因素，以保證DNA的完整性，為后續(xù)的實驗打下基礎(chǔ)。

4、質(zhì)粒抽提

質(zhì)粒抽提方法即去除RNA，將質(zhì)粒與細(xì)菌基因組 DNA分開，去除蛋白質(zhì)及其它雜質(zhì)，以得到相對純凈的質(zhì)粒。

核酸提取的主要步驟

1、裂解細(xì)胞

去除與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)以及多糖、脂類等生物大分子，去除其他不需要的核酸分子，如提取DNA分子時，應(yīng)去除RNA，反之亦然。

2、沉淀核酸

純化核酸，去除鹽類，有機(jī)劑等雜質(zhì)

核酸提取純化方法

1、酚/氯仿抽提法

1956年發(fā)明，通過酚/氯仿處理細(xì)胞破碎液或者組織勻漿后，在水相中主要溶解以DNA為主的核酸成分，在有機(jī)相中主要是脂類物質(zhì)，蛋白質(zhì)位于兩相之間。

DNA提取的經(jīng)典方法，即所謂的酚-氯仿提取法。因為使用兩種不同的有機(jī)溶劑交替抽提更容易將蛋白除去，提取次序為酚、酚/氯仿（1：1）、氯仿，這種方法提取的DNA純度高、片段大、效果好，缺點是較為繁瑣。

說明：

回收上層水相時，一定不要接觸兩相的界面，以免將蛋白質(zhì)等物質(zhì)吸入新離心管。沉淀DNA，無水乙醇是首選的有機(jī)溶劑。另：異丙醇、醋酸鈉等。70%乙醇漂洗DNA，是為了去除殘余的鹽類，去除過量SDS和酚等雜物，因為SDS在70%的乙醇中保持溶解狀態(tài)，不與DNA共沉淀，從而通過棄上清液去除這種去污劑,避免對以后PCR反應(yīng)的影響。TE緩沖液：10mmol/L Tris-Hcl 1mmol/L EDTA pH 8.5或 8

2、醇沉淀法

乙醇能夠消除核酸的水化層，使帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)暴露出來，NA﹢等帶正電荷離子能與磷酸基團(tuán)結(jié)合，形成沉淀。

3、層析柱法

旋轉(zhuǎn)離心柱技術(shù)是用于微量核酸分離純化的較為簡單的方法，屬于硅吸附方法的一種，市場上的離心柱雖各有特色，但在原理上通常可分為三個部分：

（1）利用裂解液促使細(xì)胞破碎，使細(xì)胞中的核酸釋放出來。

（2）把釋放出的核酸特異地吸附在特定的硅載體上，這種載體只對核酸有較強(qiáng)的親和力和吸附力，對其他生化成分如蛋白質(zhì)、多糖、脂類則基本不吸附，因而在離心時被甩出柱子。

（3）把吸附在特異載體上的核酸用洗脫液洗脫下來，分離得到純化的核酸。

4、熱裂解堿法

堿法提取主要是利用共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒與線性染色質(zhì)在拓?fù)鋵W(xué)上的差異來分離他們，在堿性下，變性蛋白是可溶的。

5、煮沸裂解法

加熱處理DNA溶液，利用線性DNA分子的特性，通過離心將DNA片段與變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片形成的沉淀分離。

6、納米磁珠法

運(yùn)用納米技術(shù)對超順磁性納米顆粒的表面進(jìn)行改良和表面修飾后，制備成超順磁性氧化硅納米磁珠。依據(jù)與硅膠膜離心柱相同的原理，運(yùn)用納米技術(shù)對超順磁性納米顆粒的表面進(jìn)行改良和表面修飾后，制備成超順磁性氧化硅納米磁珠。該磁珠能在微觀界面上與核酸分子特異性地識別和高效結(jié)合。利用氧化硅納米微球的超順磁性，在Chaotropic鹽（鹽酸胍、異硫氰酸胍等）和外加磁場的作用下，能從血液、動物組織、食品、病原微生物等樣本中的DNA和RNA分離出來，可應(yīng)用在臨床疾病診斷、輸血安全、法醫(yī)學(xué)鑒定、環(huán)境微生物檢測、食品安全檢測、分子生物學(xué)研究等多種領(lǐng)域。

7、其他方法

除了上述常用的方法之外，還有超聲法、反復(fù)凍融法、酶解法及低滲裂解等等多種方法。