【必看】微生物檢測實驗中無菌操作的細(xì)節(jié)

微生物的檢驗工作對環(huán)境有特殊的要求。潔凈環(huán)境是微生物檢驗工作中必須的環(huán)境基礎(chǔ)。微生物檢驗工作所處的無菌室必須注意定期消毒。避免檢測物受到污染。今天咱們就聊一聊微生物檢驗中的無菌操作技術(shù)。

無菌室的工作要盡可能減少交流。不允許在無菌室內(nèi)談笑。要盡可能減少在無菌室內(nèi)走動。沉降菌技術(shù)必須按照規(guī)定的時間進(jìn)行使用。工作人員進(jìn)入無菌室工作之前必須做好前期準(zhǔn)備工作。

要按照規(guī)定穿戴經(jīng)過特殊處理的服裝、并對身體做好清潔、避免對檢測品造成污染。在檢測樣品的提取過程中，工作人員要盡可能遠(yuǎn)離檢測物品。避免檢測物品受到細(xì)菌污染。檢測樣品提取之后要進(jìn)行科學(xué)的保存，避免受到污染。提取過程要盡可能加快速度，不能將檢測樣品在空氣中閑置太長的時間避免空氣中的細(xì)菌對檢測樣品造成污染。

檢測樣品的提取過程必須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作的程序。打開儲存樣品的時候，要使用濃度為75%的酒精對存在檢測樣品的器皿瓶口進(jìn)行消毒，要使用酒精棉球作為消毒的重要工具。器皿的瓶口要進(jìn)行兩次以上的酒精消毒，提取工作完成之后要科學(xué)的安放檢測樣品，并且隨時檢查儲存檢測樣品的空間，避免檢測樣品受到污染。
無菌操作的重要性

所謂無菌，指的是不存在保證生命活動的營養(yǎng)細(xì)胞的狀態(tài)。而無菌操作則是采用無菌的器械進(jìn)行操作，防止微生物進(jìn)入無菌范圍的技術(shù)。在微生物檢驗中，無菌操作是重要的理念，只有采用無菌操作技術(shù)，保持樣本在檢驗過程中不受到二次污染，才能保證檢驗結(jié)準(zhǔn)確的反映出樣本的衛(wèi)生狀況。

在檢驗的各個環(huán)節(jié)，都有可能有微生物的進(jìn)入，因此無菌操作技術(shù)應(yīng)貫穿整個檢驗過程，如果有一個環(huán)節(jié)沒有采用無菌操作，那么其他環(huán)節(jié)的無菌操作也將沒有任何意義。

無菌操作的具體應(yīng)用

1、取樣

微生物檢驗首先是從樣本中無菌稱取要求檢驗的質(zhì)量，取樣過程中使用的天平要經(jīng)過消毒，檢驗用品如剪刀、藥匙要經(jīng)過170℃/2h 干熱滅菌。取樣過程嚴(yán)格按照無菌操作進(jìn)行，才能保證樣品的原始狀態(tài)。

前處理

根據(jù)國標(biāo)要求，取樣后要對樣品進(jìn)行前處理。一般而言，稱取 25g/ml 樣品于盛有225ml無菌稀釋液的無菌均質(zhì)袋中均質(zhì)，制備成1:10樣品勻液進(jìn)行檢驗。對于計數(shù)樣品要，制備10倍系列稀釋樣品勻液，操作方法參見GB4789.2-2016。整個過程必須嚴(yán)格按照無菌操作進(jìn)行。

3、純種分離

在微生物檢查過程中，為了更加準(zhǔn)確的確定微生物群體，需要將疑似的目標(biāo)菌從混雜的樣品中分離出來，進(jìn)而得到純培養(yǎng)物。

通常情況下，需要結(jié)合不同微生物的具體特性，針對性的選擇培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件，促進(jìn)目標(biāo)微生物的繁殖?；蛘咄ㄟ^使用某種抑制素，抑制除目標(biāo)菌以外的雜菌生長，進(jìn)而將其他雜菌淘汰。接著將培養(yǎng)物接種在固體培養(yǎng)基上形成目標(biāo)菌的單菌落。這種單菌落還需要進(jìn)行一定的純化與鑒定，才能保障分離的菌株為純菌株。

在整個分離純化過程中，通常需要用接種環(huán)把微生物的純培養(yǎng)物從一個器皿轉(zhuǎn)接到另一個器皿中培養(yǎng)。在這一過程中，如果不能嚴(yán)格按照無菌操作進(jìn)行，很難保證檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。同時，實驗人員應(yīng)加強自身實驗水平與操作能力，確保無菌操作技術(shù)熟練、準(zhǔn)確。

4、革蘭氏染色

革蘭氏染色技術(shù)是微生物確認(rèn)鑒定中重要的方法，將疑似的目標(biāo)菌經(jīng)過純化分離后染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察微生物形態(tài)，能初步鑒定微生物是否是所檢驗的目標(biāo)菌。革蘭氏染色的操作步驟：涂片—初染—媒染—脫色—復(fù)染，整個過程中最重要的是涂片，涂片過程中必須嚴(yán)格無菌操作，避免雜菌混入，影響鏡檢結(jié)果。

5、空白對照

根據(jù)《GB4789.2-2016 安全國家標(biāo)準(zhǔn)微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)測定》，將營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾入加有1mL空白稀釋液滅菌培養(yǎng)皿內(nèi)作空白對照?？瞻讓φ盏慕Y(jié)果可以說明三個問題：

① 檢驗過程中所使用的檢驗用品滅菌是否徹底；

② 無菌室的空氣條件是否達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)；

③ 操作人員的無菌操作技術(shù)是否規(guī)范。

通過空白對照的結(jié)果可直接檢驗出實驗器皿、實驗條件以及實驗人員的操作是否達(dá)到無菌操作的要求。只有空白對照結(jié)果符合要求，實驗結(jié)果才是有效的。

操作人員在進(jìn)行微生物檢驗時，一定要樹立無菌操作觀念，規(guī)范無菌操作程序，才能保證檢驗流程順利完成。同時，操作人員要根據(jù)實際需要，合理運用無菌操作技術(shù)，避免在微生物檢驗中，引入雜菌，影響檢驗結(jié)果的真實性、準(zhǔn)確性。