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抗體藥物是目前生物技術(shù)藥物研究中最為活躍的領(lǐng)域，特別是在腫瘤和自身免疫性疾病等方面的臨床應(yīng)用，更是大放異彩。隨著臨床需求的增加，單克隆抗體藥物發(fā)展迅速，F(xiàn)DA已批準的抗體藥物多達70多個，抗體藥物銷售量年增長率基本在10%以上，大大高于制藥行業(yè)平均水平，其市場規(guī)模已經(jīng)達到千億美元。

我國針對單克隆抗體藥物的研究與開發(fā)也是如火如荼，行業(yè)內(nèi)競爭異常激烈。據(jù)統(tǒng)計我國生物類似藥研發(fā)占全球在研類似藥總數(shù)的36%。目前，我國約有600家企業(yè)在抗體藥物領(lǐng)域布局，約有200家企業(yè)已提交抗體藥物臨床試驗申請，且靶點比較集中，以TNF-α、EGFR、VEGF、HER2為主。

高速增長的抗體藥物正在改變包括癌癥在內(nèi)的多種疑難疾病的治療觀念，因此如何提高哺乳動物細胞生產(chǎn)治療性抗體的產(chǎn)量和質(zhì)量便越來越受到重視。 細胞培養(yǎng)是單克隆抗體藥物生產(chǎn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，直接影響到單抗的產(chǎn)量和質(zhì)量。細胞培養(yǎng)過程的不穩(wěn)定，一方面使得不同批次細胞培養(yǎng)的最終抗體產(chǎn)量和質(zhì)量不一致，影響抗體藥物的安全性；另一方面，增加細胞培養(yǎng)過程失敗的可能性，產(chǎn)生巨大的資源浪費，降低企業(yè)生產(chǎn)的經(jīng)濟效益。

用于分泌單克隆抗體的哺乳動物細胞培養(yǎng)條件比較苛刻，細胞外環(huán)境的變化容易對抗體的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生直接的影響，進而影響單抗藥物的有效性和安全性。因此，比較理想的細胞培養(yǎng)體系需滿足以下幾個條件：1、高產(chǎn)率、低成本的細胞系；2、能夠得到較高產(chǎn)量和合格質(zhì)量的培養(yǎng)基和培養(yǎng)罐條件；3、適于過程控制的在線或離線分析技術(shù)；4、對不同規(guī)模的細胞培養(yǎng)過程有充分的理解，保證規(guī)模放大的效果。

在用于單克隆抗體藥物生產(chǎn)的細胞培養(yǎng)過程中，影響抗體生產(chǎn)的穩(wěn)定性主要是以下幾個方面：在工藝參數(shù)優(yōu)化過程中，對細胞培養(yǎng)過程各個參數(shù)控制仍存在不足，難以保證過程性能一致性；對不同規(guī)模細胞培養(yǎng)過程中，不同規(guī)模的培養(yǎng)條件也有所區(qū)別，難以實現(xiàn)規(guī)模放大。針對細胞培養(yǎng)生產(chǎn)單克隆抗體中存在的難題，引入新的研究思路，增加細胞培養(yǎng)過程的理解，優(yōu)化生產(chǎn)工藝，提高單抗藥物的產(chǎn)率，保證批次間和不同規(guī)模下過程性能的一致，降低生產(chǎn)成本，已成為提高生產(chǎn)企業(yè)競爭力的重要途徑。

細胞培養(yǎng)過程中主要性能參數(shù)

在細胞培養(yǎng)過程中，通常將活細胞密度（viable cell density，VCD）、細胞活率（viability）、細胞單位生產(chǎn)率（specific productviy，Qp）、糖基化等內(nèi)容作為細胞培養(yǎng)過程中的性能指標(biāo)。

活細胞密度是指細胞生長過程中某個時間點內(nèi)單位體積內(nèi)活細胞的數(shù)目，也可以直接以活細胞數(shù)目（viable cell，VC）表達，通過比較不同時間點的活細胞密度了解培養(yǎng)罐中細胞的生長和增殖情況，對單抗生產(chǎn)至關(guān)重要。

細胞活率是某個時間點培養(yǎng)罐的單位體積內(nèi)活細胞數(shù)目占所有細胞數(shù)目的比例。在細胞培養(yǎng)的前期，細胞活率普遍較高，隨著細胞凋亡期的到來，細胞活率逐漸降低，合適的環(huán)境和培養(yǎng)方式能夠使細胞在培養(yǎng)后期保持相對較高的活率。通過流加培養(yǎng)結(jié)合培養(yǎng)基優(yōu)化的方式，提高了細胞培養(yǎng)后期的細胞活率，使細胞培養(yǎng)過程中細胞活率均保持在80%以上，實現(xiàn)了CHO細胞目標(biāo)蛋白產(chǎn)率的最大化。上述細胞密度及活率的檢測中可以使用貝克曼Vi-CELL XR細胞計數(shù)和活率檢測系統(tǒng)，在細胞培養(yǎng)工藝監(jiān)測過程中，確保抗體關(guān)鍵質(zhì)量屬性及表達量、胞密度、活性等主要指標(biāo)的穩(wěn)定性，有效的解決了過程中細胞參數(shù)的測定。Vi-CELL XR的優(yōu)勢在于，全自動測量，樣品不需要前處理，完全解放了人力，測試分析時間快，準確度高，真正為細胞培養(yǎng)過程的調(diào)整提供了保障。

細胞單位生產(chǎn)率（specific productviy，Qp）是指單位細胞單位時間內(nèi)抗體蛋白的產(chǎn)量，該指標(biāo)通常在選擇細胞系時使用。

在提高抗體生產(chǎn)的穩(wěn)定性中，以上指標(biāo)是細胞培養(yǎng)工藝優(yōu)化的主要目標(biāo)。而活細胞密度、細胞活率和細胞單位生產(chǎn)率等都對單抗的終產(chǎn)量有很大的影響。

細胞培養(yǎng)過程中的主要影響因素

在細胞培養(yǎng)過程中，除了含有表達載體的宿主細胞和培養(yǎng)基外，培養(yǎng)方式、培養(yǎng)工藝參數(shù)、代謝物、理化環(huán)境和培養(yǎng)規(guī)模等因素都會對過程性能參數(shù)產(chǎn)生影響。

2.1 工藝參數(shù)的影響

當(dāng)宿主細胞和培養(yǎng)基確定后，我們需要在實驗室進行小試規(guī)模細胞培養(yǎng)工藝參數(shù)的摸索與優(yōu)化，為細胞培養(yǎng)過程放大提供合適的大規(guī)模培養(yǎng)條件，保證放大后的大規(guī)模細胞培養(yǎng)過程有較好的一致性。通常，細胞培養(yǎng)工藝參數(shù)有溫度、pH值、溶氧（dissolved oxygen，DO值）、二氧化碳分壓（pCO2）和攪拌速率等。

細胞培養(yǎng)液的初始pH值由培養(yǎng)基中的緩沖鹽決定，在細胞培養(yǎng)過程中，pH值容易受到乳酸和NH4+等因素的影響。當(dāng)pH值超出設(shè)定的范圍時，通過往培養(yǎng)體系中補加CO2或加入NaHCO3溶液的方式將pH值控制在設(shè)定范圍。pH值對細胞的生長、代謝、重組蛋白的產(chǎn)出和糖基化都有顯著的影響。

溶氧一般選擇在20%-50%的范圍內(nèi)，這樣既能保證細胞正常代謝所需，又可以減少因糖酵解受到抑制而產(chǎn)生乳酸，也可以避免因溶氧過高導(dǎo)致對細胞的毒性。有研究發(fā)現(xiàn)，50%的溶氧與其它溶氧水平相比，細胞的生長速率沒有顯著差異，但是過低和過高的溶氧環(huán)境中，促紅細胞生成素的產(chǎn)率明顯低于10%-100%的溶氧環(huán)境。相關(guān)研究還表明，溶氧對于細胞的代謝、重組蛋白的合成和糖基化修飾也有一定的影響。

細胞培養(yǎng)液中溶解的CO2同樣會影響過程性能參數(shù)。研究表明，當(dāng)細胞培養(yǎng)液中的pCO2大于150mmHg時，細胞的生長就會受到抑制，而且抗體蛋白的產(chǎn)量也會降低。因此，細胞生長過程中產(chǎn)生的CO2需要及時排出，尤其是大規(guī)模的細胞培養(yǎng)過程中，要注意減少CO2積累對細胞生長所產(chǎn)生的影響。

溫度也是細胞培養(yǎng)過程的關(guān)鍵工藝參數(shù)之一，它對細胞的生長、抗體蛋白的產(chǎn)量和質(zhì)量具有顯著的影響。較低的培養(yǎng)溫度有利于提高細胞的單位生產(chǎn)率，減緩細胞的代謝，抑制細胞的生長，維持細胞較高的活率，提高目標(biāo)蛋白的質(zhì)量。研究發(fā)現(xiàn)，在細胞生長接近穩(wěn)定期時降低培養(yǎng)溫度，可以降低抗體蛋白中N-羥乙酰神經(jīng)氨酸的含量。

2.2 細胞培養(yǎng)過程中理化參數(shù)的影響

細胞所處的理化環(huán)境往往隨著培養(yǎng)時間的變化而變化，它們對細胞的生長和抗體蛋白的合成具有極其重要的影響。常見的理化環(huán)境參數(shù)，除了工藝參數(shù)設(shè)置的pH值和pCO2外，還包括NH4+濃度、Na+濃度、K+濃度和滲透壓（Osmolality，Osm）。有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)培養(yǎng)體系中NH4Cl的濃度大于5mM時，細胞對葡萄糖和谷氨酰胺的消耗增加，丙氨酸、甘氨酸和谷氨酸的合成增多，這種情況下細胞活率會受到抑制，其結(jié)果是細胞培養(yǎng)前期的抗體蛋白產(chǎn)率增加，抗體蛋白的糖基化受到影響。細胞膜內(nèi)外的Na+和K+濃度與跨膜轉(zhuǎn)運、能量代謝等作用密切相關(guān)，在細胞的生長、蛋白的合成分泌中發(fā)揮著重要的作用。高滲透壓能夠?qū)毎L產(chǎn)生抑制，pCO2會影響細胞的代謝，并最終影響抗體蛋白的產(chǎn)率。上述理化參數(shù)可以使用生化分析儀取樣離線檢測，對這些參數(shù)的分析有助于增加細胞培養(yǎng)過程性能參數(shù)的監(jiān)測。

2.3 細胞培養(yǎng)過程中代謝產(chǎn)物的影響

細胞所處的外環(huán)境不僅包括培養(yǎng)基和外界控制的理化條件，也包括細胞自身代謝物所形成的環(huán)境。常見的細胞代謝物主要分為營養(yǎng)成分和代謝中間產(chǎn)物，它們對細胞的生長、增殖和抗體蛋白的分泌有重要影響。對于細胞培養(yǎng)過程中代謝物的研究，有助于了解細胞不同培養(yǎng)時期的代謝狀態(tài)。

現(xiàn)階段的細胞培養(yǎng)都使用無血清成分的CD培養(yǎng)基，無血清培養(yǎng)基成分相對明確，一般含有葡萄糖、氨基酸、維生素、脂質(zhì)、核苷和生長因子等營養(yǎng)成分。葡萄糖是細胞培養(yǎng)過程中常見的碳源，而谷氨酰胺和天冬酰胺是細胞生長的氮源。在細胞培養(yǎng)過程中，需要對葡萄糖和谷氨酰胺的濃度進行監(jiān)測，減少因細胞營養(yǎng)成分不足引起的細胞生長障礙。葡萄糖通過糖酵解代謝生成乳酸，葡萄糖的消耗同時也是乳酸積累的過程，乳酸直接影響pH值，并影響細胞的代謝，乳酸在穩(wěn)定期的生成速率會有所降低。細胞培養(yǎng)過程中，通過流加葡萄糖和半乳糖同樣可以提高細胞密度和抗體蛋白的產(chǎn)率。

氨基酸是蛋白質(zhì)組成的基本單位，對細胞的生長和蛋白的合成有著重要的影響。采用不同的細胞系或是改變細胞培養(yǎng)的工藝參數(shù)，各氨基酸的代謝能力也隨之變化。針對消耗較快的氨基酸，給予適時的補給，有利于保證細胞的正常生長和提高目標(biāo)蛋白的產(chǎn)率。有實驗通過增加培養(yǎng)基中含量有限的蛋氨酸、色氨酸、天冬酰胺和絲氨酸，減少過多的丙氨酸、精氨酸、谷氨酰胺和甘氨酸的方式，不僅獲得了更高的活細胞密度，同時提高了目標(biāo)蛋白的產(chǎn)量。維生素對于維持細胞的正常生理狀態(tài)起著不可替代的作用，它是形成酶的輔基或輔酶的重要原料。在培養(yǎng)基中加入不同類別的維生素，可以提高活細胞密度，同時增加部分氨基酸的含量，能夠顯著提高抗體蛋白的產(chǎn)量。

蘋果酸、酮戊二酸和延胡索酸等是細胞三羧酸循環(huán)(TCA)的中間產(chǎn)物，這些三羧酸中間產(chǎn)物隨著細胞培養(yǎng)時間的增加，它們在培養(yǎng)基中的濃度逐漸增加。研究發(fā)現(xiàn)，乳酸代謝的變化會影響TCA循環(huán)的進行，進而影響細胞ATP的供應(yīng)，這些代謝活動的改變使過程性能參數(shù)產(chǎn)生了顯著的差異。核苷類成分是細胞生長增殖的主要原料，次黃嘌呤和胸腺嘧啶在培養(yǎng)初期加入培養(yǎng)基能夠剌激細胞的生長速度，提高單克隆抗體的產(chǎn)量。監(jiān)測這些代謝物在細胞培養(yǎng)工藝參數(shù)改變時的變化特征，揭示它們與過程性能參數(shù)之間的聯(lián)系有利于實現(xiàn)過程的調(diào)控，保證細胞培養(yǎng)過程的一致性。

2.4 細胞培養(yǎng)規(guī)模的影響

在小試規(guī)模完成工藝參數(shù)優(yōu)化后，通常需要工藝放大至中試規(guī)?；蛏a(chǎn)規(guī)模，以獲得臨床前單抗、臨床研究單抗及商業(yè)化生產(chǎn)單抗等進行后續(xù)研究或銷售。在工藝放大過程中，需要確保產(chǎn)品產(chǎn)量及關(guān)鍵質(zhì)量屬性不會發(fā)生顯著變化。所以大規(guī)模細胞培養(yǎng)的困難在于氧傳遞的限制、副產(chǎn)物的累積、細胞對剪切力的反應(yīng)以及更為完善的過程控制等。研究表明，在2000L的細胞培養(yǎng)體系里，pH和溶氧會呈梯度變化。因此，在大規(guī)模細胞培養(yǎng)的研究中，需要重點關(guān)注氧傳遞、pH變化和CO2的去除等培養(yǎng)條件的優(yōu)化。

有科學(xué)家利用代謝組學(xué)發(fā)現(xiàn)不同的培養(yǎng)規(guī)模下，細胞的代謝活動是存在差異的。因此，有理由認為不同培養(yǎng)規(guī)模下，細胞培養(yǎng)的理化條件和代謝活動是存在差異的。而了解不同規(guī)模下與過程性能參數(shù)相關(guān)的理化條件差異、代謝差異，有助于細胞大規(guī)模培養(yǎng)的成功，保證抗體蛋白產(chǎn)量及關(guān)鍵質(zhì)量屬性的一致性。

以往的研究主要采用單因素數(shù)據(jù)分析法來比較不同規(guī)模細胞培養(yǎng)過程中常見理化條件參數(shù)、代謝指標(biāo)與過程性能的相關(guān)性。但是，在細胞培養(yǎng)過程中，理化條件和代謝活動之間是相互影響的，理化環(huán)境的改變會引起細胞代謝的變化，細胞代謝的變化同樣對理化環(huán)境產(chǎn)生影響，并最終影響過程性能。因而，需要整合細胞培養(yǎng)過程中采集的理化環(huán)境參數(shù)、代謝物含量和過程性能數(shù)據(jù)，對不同規(guī)模下這三者之間的關(guān)系進行研究與比較，增加對細胞培養(yǎng)放大過程的理解，為細胞培養(yǎng)過程控制策略的開發(fā)提供參考。

目前，很少有針對大規(guī)模細胞培養(yǎng)生產(chǎn)抗體過程產(chǎn)量穩(wěn)定的報道，而保證細胞培養(yǎng)不同批次間抗體產(chǎn)量的穩(wěn)定，不僅能夠保證實驗數(shù)據(jù)的可靠性與可重復(fù)性，而且能夠滿足抗體生產(chǎn)過程對工藝穩(wěn)定性的要求，對于保證藥品生產(chǎn)的安全性及企業(yè)的經(jīng)濟效益具有重要作用。