單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)：從小樣本中獲得大見(jiàn)解

以往，大量細(xì)胞分析提供了蛋白質(zhì)、基因或代謝物的平均值。如今，單細(xì)胞分析正在揭示組織內(nèi)各個(gè)細(xì)胞之間的差異。這些信息將有助于人們從細(xì)胞和分子層面上了解因果關(guān)系，也有助于解釋復(fù)雜的疾病狀態(tài)是如何產(chǎn)生并持續(xù)存在的。

大量細(xì)胞分析無(wú)法了解不同的細(xì)胞類(lèi)型及其功能，它只能提供一個(gè)讀數(shù)，代表細(xì)胞的平均反應(yīng)。這種平均值，不僅包括感興趣的特征（比如細(xì)胞表面標(biāo)志物或其他表型），還包括實(shí)驗(yàn)假象和錯(cuò)誤，因此混淆了特定細(xì)胞對(duì)這些事件的貢獻(xiàn)。

對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)而言，單細(xì)胞分析的局限性在于樣本太小（單個(gè)細(xì)胞）以及它們所含的蛋白質(zhì)數(shù)量極少?！矮@取細(xì)胞不是問(wèn)題，“問(wèn)題在于，為了達(dá)到統(tǒng)計(jì)能力，您必須分析數(shù)百個(gè)或數(shù)千個(gè)細(xì)胞。每次LC/MC分析大約需要一小時(shí)，那么一項(xiàng)簡(jiǎn)單的研究可能就需要十天左右，前提是一切都按計(jì)劃進(jìn)行?！?br>
此外，人類(lèi)細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生8萬(wàn)到40萬(wàn)種不同的蛋白質(zhì)。并非所有蛋白都同時(shí)表達(dá)，有些是某個(gè)基本分子的不同亞型（isoform）。“大海撈針”的比喻也許是恰當(dāng)?shù)?。單?xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)方法每天最多能分析300個(gè)細(xì)胞，對(duì)每個(gè)細(xì)胞中的2500個(gè)蛋白進(jìn)行定量分析。
單細(xì)胞工作流程

單細(xì)胞流程當(dāng)然也是從樣本處理開(kāi)始。對(duì)樣本進(jìn)行處理，使細(xì)胞分開(kāi)和懸浮，然后通過(guò)熒光活化細(xì)胞分選（FACS）進(jìn)行分離。單個(gè)細(xì)胞被分配到微量滴定板的各個(gè)孔中或芯片型分析系統(tǒng)上，在那里進(jìn)行裂解。干擾質(zhì)譜分析的裂解劑需要除去，但由于純化會(huì)導(dǎo)致樣本損失，因此研究人員盡量避免使用。

FACS是細(xì)胞分選的shou選方法，但也存在缺點(diǎn)。損失率高（有時(shí)非常高），需要訓(xùn)練有素的操作人員，而且購(gòu)買(mǎi)和操作成本都很高。

當(dāng)然，損失并不僅僅發(fā)生在細(xì)胞分選階段?！罢吵淼牡鞍踪|(zhì)很難通過(guò)液相色譜（LC）分離，因此這個(gè)步驟也會(huì)造成損失。這將會(huì)進(jìn)一步造成靈敏度問(wèn)題或分析偏倚。有時(shí)，您只是無(wú)法從單個(gè)細(xì)胞的蛋白質(zhì)中產(chǎn)生足夠的離子。”

為了解決這些靈敏度問(wèn)題，一些操作方案將未標(biāo)記的載體蛋白添加到混合物中，以緩解小樣本量帶來(lái)的損失。雖然這些方法有點(diǎn)用，但仍需要質(zhì)譜技術(shù)的進(jìn)步，特別是在電離效率方面的進(jìn)步，才能處理小的樣本量和體積。

“如果沒(méi)有自動(dòng)化液體處理系統(tǒng)，這些工作流程將無(wú)法實(shí)現(xiàn)，自動(dòng)化系統(tǒng)帶來(lái)了準(zhǔn)確的納升級(jí)流體操作，以及一致性和穩(wěn)定性?！?br>
早期對(duì)單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)的嘗試使用了基質(zhì)輔助激光解吸電離（MALDI），這是一種軟電離技術(shù)，可以保留不穩(wěn)定的分子特征，并最大限度減少樣本損失和樣本制備步驟。

基于MALDI的方法是在上世紀(jì)90年代首次使用的。人們采用MALDI作為離子源，并用飛行時(shí)間（TOF）作為質(zhì)量分析器，從而提供一種功能性的單細(xì)胞分析。不過(guò)，這些技術(shù)存在三個(gè)主要缺點(diǎn)：MALDI不能在時(shí)域內(nèi)分離肽段，無(wú)法對(duì)大量蛋白質(zhì)進(jìn)行測(cè)序，而且MALDI電離的可變性會(huì)影響定量的準(zhǔn)確性。

另一種電離蛋白質(zhì)的方法，電噴霧電離（ESI），則更容易實(shí)現(xiàn)測(cè)序，因?yàn)樗苋菀着c各種分離方法（如毛細(xì)管電泳）相結(jié)合。然而，ESI需要大量的樣本制備，這可能導(dǎo)致?lián)p失，讓人們無(wú)法接受。

應(yīng)對(duì)未來(lái)的挑戰(zhàn)

單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)也許更適合勇敢的人。這項(xiàng)技術(shù)還需要很多工作，才能滿足成本、靈敏度、穩(wěn)定性和可靠性等方面的需求，應(yīng)用于日?？蒲小⑸镏圃旌驮\斷。

“不過(guò)在此之前，人們必須解決單細(xì)胞分離的挑戰(zhàn)，以及驗(yàn)證質(zhì)譜技術(shù)和流程的挑戰(zhàn)。此外，臨床背景下的技術(shù)人員還需要更多的全面整合流程。目前運(yùn)行16個(gè)樣本大約需要兩到三個(gè)小時(shí)，這也需要改進(jìn)?！?/div>

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