單細(xì)胞測(cè)序前期常見問題解答

目前，單細(xì)胞測(cè)序這項(xiàng)技術(shù)被應(yīng)用的越來越多，領(lǐng)域包括了神經(jīng)科學(xué)、腫瘤免疫、胚胎發(fā)育等等，您是否也計(jì)劃著開展相關(guān)的研究呢？心中關(guān)于單細(xì)胞的疑惑就讓遠(yuǎn)慕生物帶您從常見問題出發(fā)，逐步撥開迷霧吧。
 
1、為什么要做單細(xì)胞測(cè)序？

細(xì)胞與細(xì)胞之間的異質(zhì)性，微環(huán)境里的細(xì)微差別，這些我們關(guān)注的信息都會(huì)被常規(guī)Bulk測(cè)序所掩蓋，而單細(xì)胞水平可以將細(xì)胞一一分開，找到差異。單細(xì)胞測(cè)序首次將我們的研究拋開上帝視角，深入到細(xì)胞內(nèi)部，觀察每一個(gè)細(xì)胞的差別和相似，除了基因?qū)用?，我們也可以在?xì)胞層面和細(xì)胞類群層面進(jìn)行多維度的解析。

2、單細(xì)胞測(cè)序?qū)λ蜆佑惺裁匆螅?br>
制備好的單細(xì)胞懸液或血液、組織均可，質(zhì)量要求：細(xì)胞活性大于80%，細(xì)胞濃度介于5*10^5—1.2*10^6/ml，細(xì)胞總數(shù)最好大于10^5個(gè)，細(xì)胞培養(yǎng)基及緩沖液不能含Ca2+和Mg2+，細(xì)胞體積需小于40μm，大于5μm。不同物種、不同組織，包含的細(xì)胞類型多種多樣。針對(duì)同一個(gè)組織，根據(jù)研究的生物學(xué)問題，對(duì)不同細(xì)胞類別的需求也是千差萬別。派森諾的單細(xì)胞懸液制備研發(fā)團(tuán)隊(duì)，針對(duì)不同的物種、不同的組織類型、不同的實(shí)驗(yàn)處理方式、不同的感興趣的細(xì)胞類型設(shè)計(jì)一對(duì)一高度個(gè)性化的解離方案。取樣細(xì)節(jié)、運(yùn)輸細(xì)節(jié)，方方面面，為您高度個(gè)性化的研究保駕護(hù)航。

3、細(xì)胞懸液的制備過程中是否會(huì)影響基因的表達(dá)？

目前常用的方法中，不管是酶消化還是機(jī)械操作都會(huì)不可避免的對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生影響，前者會(huì)使細(xì)胞產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，后者則容易損傷細(xì)胞，進(jìn)而影響細(xì)胞活性。所以，在單細(xì)胞測(cè)序?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)時(shí)，設(shè)置對(duì)照是非常重要的。前述的這些影響，在case和control中同樣存在，我們關(guān)注case和control的差異表達(dá)基因，就可以去除實(shí)驗(yàn)的系統(tǒng)誤差，找到?jīng)Q定感興趣生物學(xué)過程的關(guān)鍵基因。

4.、10XGenomics單細(xì)胞平臺(tái)有什么優(yōu)勢(shì)？

一.細(xì)胞通量高，一次可捕獲上萬細(xì)胞 ；

二.對(duì)細(xì)胞大小及類型限制低，且捕獲效率高達(dá)65% ；

三.性價(jià)比高，且從懸液到文庫構(gòu)建周期短。

5、如何判定數(shù)據(jù)質(zhì)量？

拿到一個(gè)高質(zhì)量的數(shù)據(jù)，第一步是需要獲得高質(zhì)量的單細(xì)胞懸液。單細(xì)胞懸液的細(xì)胞活性，要求大于80%。目前常用的是AO/PI染色和臺(tái)盼藍(lán)染色法。相比較而言，臺(tái)盼藍(lán)染色會(huì)有一定的假陰性。針對(duì)用臺(tái)盼藍(lán)染色做的植物原生質(zhì)體的活性測(cè)定，假陰性的比例會(huì)更高。因?yàn)楦缓~綠體的植物細(xì)胞在臺(tái)盼藍(lán)染色后顏色更深，細(xì)胞計(jì)數(shù)儀會(huì)被判定為死細(xì)胞。因此，經(jīng)驗(yàn)豐富的操作人員檢查細(xì)胞狀態(tài)，也是非常重要的一步。第二步是需要捕獲到足夠數(shù)量的高質(zhì)量的細(xì)胞。關(guān)于這一點(diǎn)的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，可結(jié)合下圖做個(gè)闡釋。

1、捕獲到的細(xì)胞數(shù)量：這是單細(xì)胞測(cè)序研究的重要參數(shù)。捕獲到的細(xì)胞數(shù)量越多，證據(jù)越充分，越有利于發(fā)表高分文章。在后續(xù)分析過程中，會(huì)再做一次細(xì)胞過濾，最終得到的細(xì)胞數(shù)目，即是每一篇單細(xì)胞測(cè)序文章都會(huì)描述的捕獲到的細(xì)胞數(shù)目。

2、是細(xì)胞中的平均reads數(shù)，相當(dāng)于測(cè)序深度，一般大于3萬是比較好的數(shù)據(jù)。

3、是細(xì)胞中的中位基因值，該值的大小與不同的組織樣本有關(guān)，如癌細(xì)胞中可能數(shù)值較高。

4、是測(cè)序的飽和度，一般大于50%即可。

5、是本次測(cè)序得到的reads比對(duì)到高質(zhì)量細(xì)胞的占比，也是后續(xù)用來分析的數(shù)據(jù)。如果細(xì)胞活性偏低，細(xì)胞破裂較多，游離到環(huán)境中的mRNA偏多，這個(gè)數(shù)值會(huì)偏低。

6、如何判斷細(xì)胞類型？

細(xì)胞類型的判斷是需要您自己選擇Marker基因的，您可以參考同類物種或樣本的已發(fā)表文章，或者根據(jù)數(shù)據(jù)庫去確定Marker，比如CellMarker，panglao等。

細(xì)胞是生命活動(dòng)的基本單位，而如今科技的發(fā)展讓我們有能力有機(jī)會(huì)去對(duì)它進(jìn)行探索，去一展它的全貌，去窺探復(fù)雜生命背后的深層機(jī)制，我們相信在未來較長(zhǎng)的一段時(shí)間內(nèi)，隨著單細(xì)胞測(cè)序的發(fā)展及數(shù)據(jù)的積累，關(guān)于表型、基因型與環(huán)境之間的脈絡(luò)會(huì)越來越清晰，讓我們能更加深入的了解自然了解自己。