單細胞測序前期常見問題解答

目前，單細胞測序這項技術被應用的越來越多，領域包括了神經(jīng)科學、腫瘤免疫、胚胎發(fā)育等等，您是否也計劃著開展相關的研究呢？心中關于單細胞的疑惑就讓遠慕生物帶您從常見問題出發(fā)，逐步撥開迷霧吧。
 
1、為什么要做單細胞測序？

細胞與細胞之間的異質(zhì)性，微環(huán)境里的細微差別，這些我們關注的信息都會被常規(guī)Bulk測序所掩蓋，而單細胞水平可以將細胞一一分開，找到差異。單細胞測序首次將我們的研究拋開上帝視角，深入到細胞內(nèi)部，觀察每一個細胞的差別和相似，除了基因?qū)用妫覀円部梢栽诩毎麑用婧图毎惾簩用孢M行多維度的解析。

2、單細胞測序?qū)λ蜆佑惺裁匆螅?br>
制備好的單細胞懸液或血液、組織均可，質(zhì)量要求：細胞活性大于80%，細胞濃度介于5*10^5—1.2*10^6/ml，細胞總數(shù)最好大于10^5個，細胞培養(yǎng)基及緩沖液不能含Ca2+和Mg2+，細胞體積需小于40μm，大于5μm。不同物種、不同組織，包含的細胞類型多種多樣。針對同一個組織，根據(jù)研究的生物學問題，對不同細胞類別的需求也是千差萬別。派森諾的單細胞懸液制備研發(fā)團隊，針對不同的物種、不同的組織類型、不同的實驗處理方式、不同的感興趣的細胞類型設計一對一高度個性化的解離方案。取樣細節(jié)、運輸細節(jié)，方方面面，為您高度個性化的研究保駕護航。

3、細胞懸液的制備過程中是否會影響基因的表達？

目前常用的方法中，不管是酶消化還是機械操作都會不可避免的對細胞產(chǎn)生影響，前者會使細胞產(chǎn)生應激反應，后者則容易損傷細胞，進而影響細胞活性。所以，在單細胞測序?qū)嶒炘O計時，設置對照是非常重要的。前述的這些影響，在case和control中同樣存在，我們關注case和control的差異表達基因，就可以去除實驗的系統(tǒng)誤差，找到?jīng)Q定感興趣生物學過程的關鍵基因。

4.、10XGenomics單細胞平臺有什么優(yōu)勢？

一.細胞通量高，一次可捕獲上萬細胞 ；

二.對細胞大小及類型限制低，且捕獲效率高達65% ；

三.性價比高，且從懸液到文庫構建周期短。

5、如何判定數(shù)據(jù)質(zhì)量？

拿到一個高質(zhì)量的數(shù)據(jù)，第一步是需要獲得高質(zhì)量的單細胞懸液。單細胞懸液的細胞活性，要求大于80%。目前常用的是AO/PI染色和臺盼藍染色法。相比較而言，臺盼藍染色會有一定的假陰性。針對用臺盼藍染色做的植物原生質(zhì)體的活性測定，假陰性的比例會更高。因為富含葉綠體的植物細胞在臺盼藍染色后顏色更深，細胞計數(shù)儀會被判定為死細胞。因此，經(jīng)驗豐富的操作人員檢查細胞狀態(tài)，也是非常重要的一步。第二步是需要捕獲到足夠數(shù)量的高質(zhì)量的細胞。關于這一點的質(zhì)控標準，可結(jié)合下圖做個闡釋。

1、捕獲到的細胞數(shù)量：這是單細胞測序研究的重要參數(shù)。捕獲到的細胞數(shù)量越多，證據(jù)越充分，越有利于發(fā)表高分文章。在后續(xù)分析過程中，會再做一次細胞過濾，最終得到的細胞數(shù)目，即是每一篇單細胞測序文章都會描述的捕獲到的細胞數(shù)目。

2、是細胞中的平均reads數(shù)，相當于測序深度，一般大于3萬是比較好的數(shù)據(jù)。

3、是細胞中的中位基因值，該值的大小與不同的組織樣本有關，如癌細胞中可能數(shù)值較高。

4、是測序的飽和度，一般大于50%即可。

5、是本次測序得到的reads比對到高質(zhì)量細胞的占比，也是后續(xù)用來分析的數(shù)據(jù)。如果細胞活性偏低，細胞破裂較多，游離到環(huán)境中的mRNA偏多，這個數(shù)值會偏低。

6、如何判斷細胞類型？

細胞類型的判斷是需要您自己選擇Marker基因的，您可以參考同類物種或樣本的已發(fā)表文章，或者根據(jù)數(shù)據(jù)庫去確定Marker，比如CellMarker，panglao等。

細胞是生命活動的基本單位，而如今科技的發(fā)展讓我們有能力有機會去對它進行探索，去一展它的全貌，去窺探復雜生命背后的深層機制，我們相信在未來較長的一段時間內(nèi)，隨著單細胞測序的發(fā)展及數(shù)據(jù)的積累，關于表型、基因型與環(huán)境之間的脈絡會越來越清晰，讓我們能更加深入的了解自然了解自己。