親和素一生物素復合物法（ABC法）實驗操作步驟

親和素一生物素復合物法（ABC法）

(1）冰凍切片用0.0lmol/L PBST（或PBS）漂洗或沖洗3次，每次5min。

(2) 3 % H2O2孵育l0min（耗竭內(nèi)源性過氧化氫酶），再用0. 0l mol/L PBS沖洗3次，每次5min,

(3) 5％-8％的正常動物血清（山羊或馬血清）孵育30-60min,封閉組織片的非特異性結(jié)合。

(4）洗掉血清，滴加合適濃度的一抗，如1 :500 (0. 01 mol/L PBS配制），4℃過夜。

(5) 吸出一抗，0. 0 1 mol/L PBS沖洗3次，每次5min，加入同一源性的二抗（0. 0l mol/L PBS配制），室溫2h（最好在搖床上進行）。

(6）吸出二抗，0. 01 mol/L PBS沖洗3次，每次5min，加入三抗(0. 0lmol/L PBS配制），室溫2h（在搖床上進行）。

(7) DAB顯色。顯色結(jié)束后，0. 1 mol/L PB洗2次，每次5min,終止顯色。

(8) 切片（漂染還需要裱片）脫水、透明：70%、80%、90%、100％酒精各5min，二甲苯（1)、 (2）各10min，中性樹膠封片。典型的實驗結(jié)果見圖20. 2A。

注意事項：

(1) 準備：免疫組織化學要求實驗器具絕對無污染，因此，所使用的玻璃器皿、載玻片、蓋玻片均需在濃酸中處理至少24小時，取出后自來水沖洗干凈，用蒸餾水浸泡，再取出晾干備用。實驗中盡量避免交叉使用吸管和移液器槍頭等。

(2) 切片注意事項：切片開始前，要先將組織冷凍，可置入液氮中停留數(shù)秒鐘（用錫紙包裹）迅速冷凍。使用冷凍式切片機前，刀片及接觸冰凍切片的物體需要預冷。如使用一次性刀片需及時更換，非一次性刀片要注意保養(yǎng)，微小的缺口也可能造成組織切片出現(xiàn)劃痕，影響實驗結(jié)果。

(3）根據(jù)蛋白所在的位置，選用PBST或PBS，如果蛋白在細胞膜上，則不推薦加入Triton X-100；如果是核內(nèi)的蛋白，可適當增加Triton X-100的濃度。

(4) H2O2的作用是用來耗竭內(nèi)源性的過氧化物酶，組織內(nèi)的過氧化物酶可催化顯色的底物，從而造成假陽性或增加背景。如果組織沖洗不夠充分或染色背景較高，可適當延長其孵育的時間或提高H2O2的濃度。

(5）封閉用的血清應與產(chǎn)生二抗的動物同源，從而達到消除非特異性染色的目的。

(6) 一抗的選擇至關(guān)重要，多克隆和單克隆抗體各有優(yōu)點，抗體的選用應根據(jù)具體的目的，詳細閱讀抗體的說明書，并尋找可能的文獻作參考。一抗的濃度及時間，要在預實驗時進行梯度的篩選，以推薦濃度作為中間濃度，上下調(diào)整一抗的濃度。理想的染色結(jié)果應是無背景而只有抗原顯色。二抗的濃度也應進行適當?shù)拿??？贵w的保存和使用，應參照說明書。

(7) DAB一定要現(xiàn)用現(xiàn)配，盡量避光保存。顯色的時間應在鏡下控制。

(8) 免疫組化的對照實驗必不可少，對照可分為陰性對照和陽性對照，陰性對照指用緩沖液代替一抗，而其他步驟不變。陽性對照一般用常見的蛋白如細胞骨架蛋白（actin)或者用不同的組織（如說明書上所用的）進行同一抗體的染色。