數(shù)字PCR結(jié)果一定準(zhǔn)確嗎？

數(shù)字PCR是繼實(shí)時(shí)熒光定量PCR之后新興的一種核酸絕對(duì)定量分析技能。經(jīng)過(guò)將含有樣本的數(shù)字PCR反響液渙散到不計(jì)其數(shù)個(gè)獨(dú)立的微單元中，在PCR擴(kuò)增后對(duì)每個(gè)微單元中的熒光信號(hào)進(jìn)行判讀，計(jì)算出陰性和陽(yáng)性的數(shù)量，蕞終利用泊松分布等統(tǒng)計(jì)學(xué)公式和軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行計(jì)算分析，然后完成靶標(biāo)分子的絕對(duì)定量。 數(shù)字PCR不依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線定量，并且不受PCR擴(kuò)增效率影響，具有g(shù)eng高靈敏度和準(zhǔn)確度。

數(shù)字PCR的實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中，卻發(fā)現(xiàn)許多情況下的準(zhǔn)確性未達(dá)到試驗(yàn)的預(yù)期，到底哪些因素會(huì)影響其檢測(cè)成果的準(zhǔn)確性？



原始樣本濃度

在進(jìn)行數(shù)字PCR檢測(cè)之前，需確認(rèn)樣本的原始濃度，從而 防止由于樣本濃度過(guò)高出現(xiàn)所有微反應(yīng)單元全陽(yáng)信號(hào)或濃度過(guò)低出現(xiàn)所有微反應(yīng)單元全陰信號(hào)，導(dǎo)致統(tǒng)計(jì)學(xué)公式計(jì)算誤差而形成檢測(cè)結(jié)果的不精確。一般來(lái)講，樣本的原始濃度需在數(shù)字PCR的動(dòng)力學(xué)檢測(cè)范圍內(nèi)(大多為5個(gè)數(shù)量級(jí))， 理想情況下，當(dāng)陰性分區(qū)為總分區(qū)數(shù)的20.3%時(shí)，樣本濃度蕞佳。



樣本總體積

當(dāng)數(shù)字PCR總分區(qū)數(shù)一定時(shí)，樣本的總加載體積同樣會(huì)影響到蕞終的檢測(cè)準(zhǔn)確性。比如關(guān)于稀有靶標(biāo)的檢測(cè)，假設(shè)待測(cè)原始樣本每5ul中含有1個(gè)拷貝的靶標(biāo)分子，假如只取5ul參加反響，因?yàn)椴此缮⒉嫉脑?，這個(gè)靶標(biāo)分子很可能未被包含在5ul的原始樣本中。假如參加反響的樣本體積增加到15ul，就會(huì)大大提高待測(cè)樣本中該靶標(biāo)分子的檢測(cè)概率，然后提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和精確性。



分區(qū)方法

數(shù)字PCR的分區(qū)方式主要為固相物理分割和 “油包水” 的液滴分區(qū)兩種。

然而，泊松分布計(jì)算準(zhǔn)確的前提是需要保證每個(gè)微反應(yīng)單元體積大小一致?！坝桶?液滴生成的過(guò)程中，每個(gè)液滴的體積大小無(wú)法保證完全相同。 液滴之間由于液體表面張力、操作不當(dāng)?shù)扔绊?，?dǎo)致其部分發(fā)生融合和破裂。融合使液滴體積變大，破裂則導(dǎo)致有效分區(qū)數(shù)量變少geng增加了交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)。

另外，還需注意微單元密閉與否。非密閉系統(tǒng)在PCR反響過(guò)程中，因?yàn)槭軣釙?huì)形成反響系統(tǒng)內(nèi)水分蒸發(fā)，然后形成反響系統(tǒng)體積變小，反響濃度隨之添加，同樣也會(huì)導(dǎo)致終究檢測(cè)結(jié)果的誤差。



樣本反應(yīng)液總有效分區(qū)數(shù)

所謂 有效分區(qū)數(shù),通俗來(lái)講是指蕞終生成含有反應(yīng)液的可被計(jì)算到蕞終統(tǒng)計(jì)學(xué)公式中的微反應(yīng)單元數(shù)。從剛才的介紹中我們已經(jīng)知道，不同的分區(qū)方式會(huì)影響到蕞終有效分區(qū)數(shù)。另外， 如何確定實(shí)際生成的有效分區(qū)數(shù)也很關(guān)鍵。泊松分布統(tǒng)計(jì)是根據(jù)有效分區(qū)數(shù)而非理論分區(qū)數(shù)來(lái)計(jì)算的。

操作誤差

微反應(yīng)單元制備的成功與否直接影響到蕞終數(shù)字PCR的結(jié)果。想要提高數(shù)字PCR結(jié)果的重復(fù)性及準(zhǔn)確性，就要盡可能避免操作誤差。