植物愈傷組織培養(yǎng)以及再分化

實(shí)驗(yàn)概要

了解培養(yǎng)基母液的配制方法和注意事項(xiàng)；掌握培養(yǎng)基的配制和滅菌方法，掌握植物組織培養(yǎng)的一般方法

實(shí)驗(yàn)原理

（一）植物細(xì)胞的全能性  植物細(xì)胞的全能性即是每個(gè)植物的本細(xì)胞或性細(xì)胞都具有該植物的全套遺傳基因，因此在一定培養(yǎng)條件下每個(gè)細(xì)胞都可發(fā)育成一個(gè)與母體一樣的植株。這個(gè)概念雖然在本世紀(jì)初已經(jīng)提出，但在當(dāng)時(shí)的技術(shù)條件下，在實(shí)踐上并沒(méi)做到，經(jīng)過(guò)幾十年來(lái)組織培養(yǎng)技術(shù)的不斷改進(jìn)，目前細(xì)胞的全能性不但在理論上完全被證實(shí)，而且為組織培養(yǎng)在實(shí)踐上的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。 植物細(xì)胞要表現(xiàn)出全能性，須經(jīng)過(guò)幾個(gè)步驟： 成熟細(xì)胞→分生細(xì)胞→胚狀體→完整植株。  成熟細(xì)胞→愈傷組織→出根出芽→完整植株。

  脫分化也就是已經(jīng)分化定型的細(xì)胞，經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)成為重新恢復(fù)了分裂能力（也就是成為分生狀態(tài)）細(xì)胞的過(guò)程。 不但植物體細(xì)胞可以表現(xiàn)全能性，花粉在培養(yǎng)條件下也可能進(jìn)行脫分化，通過(guò)愈傷組織或胚狀體發(fā)育成單倍體植株。 誘導(dǎo)細(xì)胞的脫分化，需要許多外界條件。任何一個(gè)分化的細(xì)胞都具有保持分生組織狀態(tài)的潛勢(shì)，不過(guò)它平常處于受抑制的狀態(tài)，消除抑制作用就可以使細(xì)胞恢復(fù)分裂。在各種外界條件中，外源激素對(duì)脫分化起重要作用。有些植物的外植體僅需加入生長(zhǎng)素（IAA"吲哚乙酸"，NAA"萘乙酸"，2，4-D）即可誘導(dǎo)細(xì)胞的分裂與生長(zhǎng)，如菊苣；有的僅需加入加細(xì)胞激動(dòng)素類，如大豆、蘿卜；另一類需加生長(zhǎng)素和細(xì)胞激動(dòng)素類，如煙草髓、胡蘿卜、馬鈴薯；還有一類不需加任何激素，如冠癭組織，煙草腫瘤組織。

（二）組織的分化與器官建成  外植體誘導(dǎo)出愈傷組織后，經(jīng)過(guò)繼代培養(yǎng)，可以在愈傷組織內(nèi)部形成一類分生組織（meristemoid）即具有分生能較往年小細(xì)胞團(tuán)，然后，再分化成不同的器官原基。有些情況下，外植體不經(jīng)愈傷組織而直接誘導(dǎo)出芽、根。所以器官發(fā)生有兩種方式，即直接和間接的。  （1）外植體→器官發(fā)生（根、芽或胚狀體）→再生植株。 （2）外植體→愈傷組織→類分生組織→根、芽→再生植株。 根是組織培養(yǎng)中易形成的器官，形成芽的培養(yǎng)基條件常有不同，有時(shí)芽與根可以同時(shí)在組織培養(yǎng)中形成，一般說(shuō)，培養(yǎng)物中形成的芽如胡蘿卜懸浮培養(yǎng)，油菜愈傷組織等。在組織培養(yǎng)中通過(guò)根、芽誘導(dǎo)再生植株方式有三種：一種在芽產(chǎn)生之后，于芽形成的基部長(zhǎng)根而形成小植株，一種是在根上生長(zhǎng)出芽來(lái)，另一種即在愈傷組織的不同部位分別形成芽和根，然后兩者結(jié)合起來(lái)形成一株植物。 

（三）培養(yǎng)基的組成 培養(yǎng)基中各成分的比例及濃度與細(xì)胞或組織的生長(zhǎng)或分化所需要的最佳條件相近似成功地使用該培養(yǎng)基進(jìn)行組織培養(yǎng)的主要條件。營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基一般由無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)、碳源和能源、維生素、植物激素（生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑）和包括有機(jī)氮、酸和復(fù)雜物質(zhì)的添加劑組成。

1、無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)：礦質(zhì)元素（礦物質(zhì)）對(duì)植物的生命非常重要。例如：Ca是細(xì)胞壁的組成成分；氮是氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸和維生素的重要組成成分；鎂是葉綠素的組成成分；鐵、鋅和鉬是某些酶的組成成分。除了C、H、N、O外，還有12種其他元素是植物生長(zhǎng)所必需的。植物對(duì)元素的需求濃度大于0.5mol/L時(shí)，這些元素稱為大量元素；而需求濃度小于0.5mol/L的元素則成為微量元素。和一般植物對(duì)元素的需求一樣，多種鹽能滿足組織培養(yǎng)對(duì)微量元素和大量元素的需求。N、K、P、Ca、S、Mg為大量元素。必需的微量元素有Fe、Mn、B、Cu、Zn、I、Mo、Co，植物對(duì)這些元素的需求量為微摩爾每升數(shù)量級(jí)。為了獲得最大的生長(zhǎng)速度，每種營(yíng)養(yǎng)成分的最佳濃度可以有相當(dāng)大的變化。當(dāng)?shù)V物鹽溶解在水中時(shí)，他們被解離。培養(yǎng)基中的活化因子是不同種類的離子，而不是化合物。因此，通過(guò)對(duì)培養(yǎng)基中不同種類離子濃度的測(cè)定，就可以對(duì)兩種培養(yǎng)基做出比較。在大多數(shù)情況下，一種營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基所含的無(wú)機(jī)氮在25~60mmol/L之間。細(xì)胞能夠在硝酸鹽單獨(dú)存在的情況下生長(zhǎng)，但是在更多的情況下，銨或者其他還原態(tài)氮對(duì)植物的生長(zhǎng)又明顯的好處。另外，當(dāng)培養(yǎng)基中僅含硝酸鹽時(shí)，pH會(huì)升高。當(dāng)培養(yǎng)基中同時(shí)含有硝酸鹽和少量的銨化合物時(shí)，pH的這種變化就會(huì)被抑制。硝酸鹽和銨的應(yīng)用范圍分別在25~40mmol/L和2~20mmol/L。對(duì)銨的響應(yīng)得變化從抑制到必需依賴于組織類型和培養(yǎng)目的。在銨的量超過(guò)8mmol/L的情況下，或者組織生長(zhǎng)在僅含這種氮素的培養(yǎng)基中時(shí)，培養(yǎng)液中也應(yīng)該含有檸檬酸鹽、蘋(píng)果酸、琥珀酸或者其他TCA循環(huán)中的酸。大多數(shù)植物選擇硝酸鹽而不是銨，相反的情況也存在于另外一些植物中。鉀的需要濃度為2~26mmol/L，鉀一般以硝酸鹽或氯化物的形式提供，鈉不能代替鉀。濃度為1~3mmol/L的Ca、硫酸鹽、磷酸鹽和Mg通常能滿足要求。培養(yǎng)基中的Fe通常以螯合物的形式加入，當(dāng)pH達(dá)到8時(shí)，這種形式的Fe仍可利用。

2、碳源和能源：沒(méi)有例外，標(biāo)準(zhǔn)碳源是蔗糖或葡萄糖。果糖也可以作為碳源，但是效果要差一些。培養(yǎng)基中的蔗糖可以迅速地轉(zhuǎn)化為葡萄糖和果糖。葡萄糖首先被利用，然后是果糖。培養(yǎng)基中的蔗糖濃度一般為2%~5%。其他的碳水化合物，包括乳糖、麥芽糖、半乳糖和淀粉也被使用做碳源，但是這下化合物的效果一般比蔗糖和葡萄糖差。大多數(shù)培養(yǎng)基含肌醇，其濃度約為100mg/L。肌醇可以改善細(xì)胞的生長(zhǎng)。

3、維生素：正常植物（相對(duì)離體植物而言）可以合成其生長(zhǎng)和發(fā)育所需要的維生素。但是，植物細(xì)胞的體外培養(yǎng)需要在培養(yǎng)基中加入維生素。維生素B1是植物生長(zhǎng)和發(fā)育所必需的。煙酸和維生素B6可以改善細(xì)胞或離體植物的生長(zhǎng)。一些培養(yǎng)基中含泛酸、生物素、葉酸、對(duì)氨基苯甲酸、氯化膽堿、核黃素和抗壞血酸。

4、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑：激素是高等植物合成的有機(jī)化合物，它們影響植物的生長(zhǎng)和發(fā)育。植物激素的量很小，而且通常在產(chǎn)生它們的部位以外的地方作用。除了自然化合物，人們還合成了與自然激素相同的化合物。所有這些激素統(tǒng)稱為生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。主要的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑有兩類，它們?cè)诼殑?wù)組織培養(yǎng)中具有特殊的重要性： ⑴生長(zhǎng)素   生長(zhǎng)素的共同特點(diǎn)是它們具有能導(dǎo)致細(xì)胞分裂和形成愈傷組織的性質(zhì)。生長(zhǎng)素引起細(xì)胞分裂、細(xì)胞生長(zhǎng)和組織增大及不定根的形成。它經(jīng)常抑制不定芽和腋芽的形成。當(dāng)生長(zhǎng)素的濃度較低時(shí)，不定根的形成占主導(dǎo)地位，然而，當(dāng)生長(zhǎng)素的濃度較高時(shí)，愈傷組織能夠形成，而根不能夠形成。最常用的高效化合物是2，4—二氯苯氧乙酸（2，4—T）。其他可以使用的生長(zhǎng)素是萘乙酸（NAA）、吲哚丁酸（IBA）、2，4，5—三氯苯氧乙酸（2，4，5—T）、對(duì)氯苯氧乙酸（pCPA）和毒莠定。 ⑵細(xì)胞分裂素   細(xì)胞分裂素是腺嘌呤的衍生物，它對(duì)誘導(dǎo)芽的產(chǎn)生具有重要作用。最常用的細(xì)胞分裂素有激動(dòng)素、苯甲基嘌呤（BA）或6—芐氨基嘌呤（BAP）、玉米素和異戊烯基嘌呤（2iP）。這些化合物通常被用于刺激植物生長(zhǎng)和發(fā)育。當(dāng)把它們和生長(zhǎng)素一起使用時(shí)，通?？梢源龠M(jìn)細(xì)胞分裂，高濃度的（1~10mg/L）時(shí)可以誘導(dǎo)不定芽的形成，但是根的形成一般被抑制。它們通過(guò)降低頂端優(yōu)勢(shì)促進(jìn)側(cè)芽的形成。 ⑶其他激素  赤霉素通常被用于植株的再生。一般情況下，赤霉素可以使節(jié)間生長(zhǎng)、引起離體分生組織或芽的生長(zhǎng)。赤霉素通常抑制不定根和不定芽的形成。 脫落酸是誘導(dǎo)胚形成的一個(gè)重要的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。

5、有機(jī)添加劑：培養(yǎng)的正常細(xì)胞能夠合成其所需要的所有氨基酸，但是，當(dāng)其中含有氨基酸（如谷氨酸）形式的有機(jī)氮和核苷酸存在時(shí)是有益的。外加氨基酸要慎重，因?yàn)檫@些氨基酸可能成為抑制劑。

6、膠凝劑：瓊脂是一種最常用的凝固劑，它在組織培養(yǎng)中作為支撐物。瓊脂的濃度過(guò)低，與水的親和力不強(qiáng)，難以形成有效的支撐；瓊脂的濃度過(guò)高，培養(yǎng)基就會(huì)變硬，妨礙營(yíng)養(yǎng)向組織中擴(kuò)散，離體生長(zhǎng)將受到負(fù)面影響。 有支撐物的液體培養(yǎng)基可以取代固體培養(yǎng)基： ①不含瓊脂的液體培養(yǎng)基，以干凈的泡沫塑料、玻璃纖維為支撐物 ②懸掛在液體培養(yǎng)基中的過(guò)濾紙橋 ③生長(zhǎng)在有玻璃珠的液體培養(yǎng)基中 ④位于濾紙下的纖維膠海綿代替瓊脂作為液體培養(yǎng)基的載體

7、pH：pH決定著生物大分子的結(jié)構(gòu)和活性的許多方面。對(duì)于外植體的離體培養(yǎng)，合適的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基的pH值為5.0~6.0。一般情況下，pH﹥7.0或pH﹤4.5時(shí)，生長(zhǎng)和發(fā)育停止。培養(yǎng)基的pH在消毒前和消毒后不相同，一般情況下，經(jīng)過(guò)高壓消毒后的培養(yǎng)基，其pH值回降低0.3~0.5。pH﹥6.0時(shí)，可以得到硬度合適的培養(yǎng)基，而pH﹤5.0時(shí)，瓊脂就不能形成令人滿意的凝膠。

主要試劑

詳見(jiàn)實(shí)驗(yàn)步驟。

主要設(shè)備

鑷子、解剖刀、培養(yǎng)皿、 苗瓶、 酒精瓶、  超凈工作臺(tái)、三角瓶、電爐等；

實(shí)驗(yàn)材料

種苗（ 從分生部上沿切取一段約25px左右的種苗莖，切好的外植體上應(yīng)保留一片苗葉，若葉片上有萎黃部位，切除之），詳見(jiàn)實(shí)驗(yàn)步驟。

實(shí)驗(yàn)步驟

1、向燒杯中順序加入培養(yǎng)基母液： 大量元素 25ml    微量元素 2.5ml    鐵鹽 2.5ml    維生素、肌醇和甘氨酸各2.5ml    BA和NAA各2.0ml

  2、加入實(shí)際配制培養(yǎng)基體積約2/3－3/4的蒸餾水，加入10g蔗糖和3.5g瓊脂，將燒杯置于電爐上，攪拌加熱使瓊脂完全溶化，然后用蒸餾水準(zhǔn)確稀釋至500ml，繼續(xù)加熱幾分鐘使之混合后分裝于10個(gè)100ml三角瓶中，以封口膜封口，用記號(hào)筆寫(xiě)上學(xué)號(hào)和姓名。 分裝好的培養(yǎng)基置于高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌，滅菌條件為溫度121℃，壓力1.1kg/cm2,滅菌時(shí)間20min左右，滅菌后的培養(yǎng)基置于無(wú)菌室保存?zhèn)溆谩?br>
  3、將超凈工作臺(tái)用75%的酒精擦拭一遍，實(shí)驗(yàn)中需要用到的器具（鑷子、解剖刀、培養(yǎng)皿）和裝培養(yǎng)基的三角瓶也用75%的酒精擦拭一遍后置于超凈工作臺(tái)中。打開(kāi)紫外燈和風(fēng)機(jī)，處理20-30分鐘。

  4、雙手用肥皂洗凈，再用75%酒精擦拭一遍后，連同用75%酒精擦拭過(guò)的種苗瓶一起進(jìn)入超凈工作臺(tái)。進(jìn)入超凈工作臺(tái)后，不得隨意出入，以免染菌。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)盡量避免手直接接觸。

  5、點(diǎn)燃酒精燈，將鑷子和解剖刀在燈焰上烘烤后，插在酒精瓶中；在燈焰附近打開(kāi)種苗瓶封口，從酒精瓶中取出鑷子和解剖刀，燈焰上烘烤后切取種苗于培養(yǎng)皿，使用過(guò)的鑷子和解剖刀放回酒精瓶（實(shí)驗(yàn)中使用鑷子和解剖刀前均需在燈焰上烘烤滅菌，使用完后放回酒精瓶；在接種時(shí)，鑷子應(yīng)盡量多烘烤一段，以防鑷子插入過(guò)深時(shí)，致使培養(yǎng)物染菌）；瓶口和封口膜內(nèi)側(cè)燈焰上烘烤后封口；實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)盡量避免手直接接觸外植體材料。

  6、從分生部上沿切取一段約25px左右的種苗莖，切好的外植體上應(yīng)保留一片苗葉，若葉片上有萎黃部位，切除之。

  7、在燈焰附近打開(kāi)培養(yǎng)基瓶封口，接種過(guò)程中，培養(yǎng)基瓶口應(yīng)一直對(duì)準(zhǔn)燈焰，手不得接觸封口膜內(nèi)側(cè)；將切好的外植體材料垂直插入培養(yǎng)基中，一瓶接種1-2個(gè)。此過(guò)程應(yīng)盡快完成后封口。

  8、接種好的三角瓶24℃培養(yǎng)。2天后觀察，若有染菌需重做。一周后愈傷組織可形成。繼續(xù)分兩組培養(yǎng)：一組24℃光照培養(yǎng)，另一組24℃黑暗環(huán)境下培養(yǎng)，觀察兩組培養(yǎng)物再分化情況。