國(guó)慶假期快到了！細(xì)胞該怎么凍存？

一般來(lái)說(shuō)，細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)移和保存，最佳的策略是進(jìn)行低溫保存（-70℃~-196℃），而細(xì)胞深低溫保存的基本原理是：在-70℃以下時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的酶活性均已停止，即代謝處于完全停止?fàn)顟B(tài)，故而可以長(zhǎng)期保存。細(xì)胞低溫保存的關(guān)鍵，在于通過(guò)0~20℃階段的處理過(guò)程，在此溫度范圍內(nèi)，冰晶呈針狀，極易招致細(xì)胞的嚴(yán)重?fù)p傷。

經(jīng)過(guò)前人的長(zhǎng)期試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的凍存及復(fù)蘇基本原則是 慢凍速融，這樣可以最大限度的保存細(xì)胞活力。 目前細(xì)胞凍存多采用甘油或二甲基亞砜作保護(hù)劑，這兩種物質(zhì)能提高細(xì)胞膜對(duì)水的通透性，加上緩慢冷凍可使細(xì)胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少由于冰晶形成造成的細(xì)胞損傷。

復(fù)蘇細(xì)胞應(yīng)采用 快速融化的方法，這樣可以保證細(xì)胞外結(jié)晶在很短的時(shí)間內(nèi)即融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細(xì)胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對(duì)細(xì)胞造成損傷。

No.1  材料準(zhǔn)備

1. 儀器：凈化工作臺(tái)、 離心機(jī)、恒溫水浴箱、冰箱（4℃、-20℃、-70℃）、倒置相差顯微鏡、培養(yǎng)箱、液氮冰箱。

2. 玻璃器皿：吸管（彎頭、直頭）、 培養(yǎng)瓶、玻璃瓶（250ml、100ml）、廢液缸。

3. 塑料器皿： 吸頭、槍頭、膠塞、移液管（10ml）、15ml離心管、凍存管（1～2ml）。

4. 其他物品：微量加樣槍、紅血球計(jì)數(shù)板、記號(hào)筆、醫(yī)用橡皮膏、移液槍。

5. 試劑：D-Hanks液、胎牛血清、培養(yǎng)液、雙抗（青霉素、鏈霉素）、胰蛋白酶（0.08%）、1NHCl、7.4%NaHCO3、DMSO（分析純）或無(wú)色新鮮甘油。

No.2  細(xì)胞凍存

1、10%的DMSO+90%胎牛血清。甘油一般用于菌種保存很少用于細(xì)胞凍存。

2、取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用胰蛋白酶把單層生長(zhǎng)的細(xì)胞消化下來(lái)，懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞則直接將細(xì)胞移至15ml離心管中。

3、離心1000 rpm,5 min。

4、去除胰蛋白酶及舊的培養(yǎng)液，加入適量配制好的凍存培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻，計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)凍存液中細(xì)胞的最終密度為5x10^6/ml~1x10^7/ml。

5、 在凍存管上標(biāo)明細(xì)胞的名稱，凍存時(shí)間及操作者。

6、凍存：標(biāo)準(zhǔn)的凍存程序?yàn)榻禍厮俾?1~-2℃/min；當(dāng)溫度達(dá)到-25℃以下時(shí)，可增至-5℃~-10℃/min；到-100℃時(shí)，則可迅速浸入液氮中。也可將裝有細(xì)胞的凍存管放入-20℃冰箱2h，然后放入-70℃冰箱中過(guò)夜，取出凍存管，移入液氮容器內(nèi)。

No.3  細(xì)胞復(fù)蘇

1. 從液氮容器中取出凍存管，直接浸入37℃溫水中，并不時(shí)搖動(dòng)令其盡快融化。

2. 從37℃水浴中取出凍存管，打開(kāi)蓋子，用吸管吸出細(xì)胞懸液，加到離心管并滴加10倍以上培養(yǎng)液，混勻。

3. 離心， 1000 rpm，5 min。

4. 棄去上清液，加入含10%小牛血清培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度，接種培養(yǎng)瓶，37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。

5. 次日更換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。

凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融

當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細(xì)胞器脫水，細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。

如果緩慢冷凍，可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶；相反，結(jié)晶就大，大結(jié)晶會(huì)造成細(xì)胞膜、綱胞器的損傷和破裂。復(fù)蘇過(guò)程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。

慢凍程序

1. 標(biāo)準(zhǔn)程序：采用細(xì)胞凍存器

當(dāng)溫度在-25 ℃以上時(shí)， 1~2 ℃/min；

當(dāng)溫度達(dá)-25 ℃以下時(shí)， 5~10 ℃/min；

當(dāng)溫度達(dá)-100℃時(shí)，可迅速放入液氮中。

2. 簡(jiǎn)易程序：將冷凍管（管口要朝上）放入紗布袋內(nèi)，紗布袋系以線繩，通過(guò)線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口，按每分鐘溫度下降1~2 ℃的速度，在40 min內(nèi)降至液氮表面過(guò)夜，次晨投人液氮中。

3. 傳統(tǒng)程序：冷凍管置于4℃ 10 分鐘→ -20℃ 30 分鐘→ -80℃ 16~18 小時(shí)（或隔夜） → 液氮槽長(zhǎng)期儲(chǔ)存。

No.4 細(xì)胞計(jì)數(shù)及存活測(cè)試

1、原理：

(1)計(jì)算細(xì)胞數(shù)目可用血球計(jì)數(shù)盤(pán)或是Coultercounter粒子計(jì)數(shù)器自動(dòng)計(jì)數(shù)。

(2)血球計(jì)數(shù)盤(pán)一般有二個(gè)chambers，每個(gè)chamber中細(xì)刻9個(gè)1mm2大正方形，其中4個(gè)角落之正方形再細(xì)刻16個(gè)小格，深度均為0.1mm。當(dāng)chamber上方蓋上蓋玻片后，每個(gè)大正方形之體積為1mm2×0.1mm=1.0x10 -4ml。使用時(shí)，計(jì)數(shù)每個(gè)大正方形內(nèi)之細(xì)胞數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)，再乘以104，即為每ml中之細(xì)胞數(shù)目。

(3)存活測(cè)試之步驟為dyeexclusion，利用染料會(huì)滲入死細(xì)胞中而呈色，而活細(xì)胞因細(xì)胞膜完整，染料無(wú)法滲入而不會(huì)呈色。一般使用藍(lán)色之trypan blue染料，如果細(xì)胞不易吸收trypan blue，則用紅色之Erythrosin bluish。計(jì)算細(xì)胞活率：活細(xì)胞數(shù)/(活細(xì)胞數(shù)+死細(xì)胞數(shù))×100%。計(jì)數(shù)應(yīng)在臺(tái)盼蘭染色后數(shù)分鐘內(nèi)完成，隨時(shí)間延長(zhǎng)，部分活細(xì)胞也開(kāi)始攝取染料;因?yàn)榕_(tái)盼蘭對(duì)蛋白質(zhì)有很強(qiáng)的親和力，用不含血清的稀釋液，可以使染色計(jì)數(shù)更為準(zhǔn)確。

2、材料：

0.4%w/v trypan blue；Erythosin bluish stain；取0.1gram Erythrosin bluish、0.05gram preservative methyl paraben溶于100mlCa++/Mg++freesaline；血球計(jì)數(shù)盤(pán)及蓋玻片(Hemocytometerandcoverslip);計(jì)數(shù)器(counter);低倍倒立顯微鏡;粒子計(jì)數(shù)器(Coultercounter,CoulterElectronics)。白細(xì)胞稀釋液(4%乙酸溶液)。

3、步驟：

(1)取50μl細(xì)胞懸浮液與50μl trypan blue(orErythrosinbluish)等體積混合均勻于1.5ml小離心管中。

(2)取少許混合液(約15μl)自血球計(jì)數(shù)盤(pán)chamber上方凹槽加入，蓋上蓋玻片，于100倍倒立顯微鏡下觀察，活細(xì)胞不染色，死細(xì)胞則為藍(lán)色(或紅色-Erythrosin bluish)。

(3)計(jì)數(shù)四個(gè)大方格之細(xì)胞總數(shù)，再除4，乘以稀釋倍數(shù)(至少乘以2，因與trypanblue等體積混合)，最后乘以104，即為每ml中細(xì)胞懸浮液之細(xì)胞數(shù)。若細(xì)胞位于線上，只計(jì)上線與右線之細(xì)胞(或計(jì)下線與左線之細(xì)胞)。

注：

4大格細(xì)胞總數(shù)×稀釋倍數(shù)×10 4/4=細(xì)胞數(shù)/ml   每一大格的體積=2.5px×2.5px×0.25px=10 -4ml

計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)時(shí)，最適濃度為5～10×10 5細(xì)胞/ml，此范圍外計(jì)數(shù)誤差偏大。高濃度細(xì)胞懸液，可取出部分作稀釋或連續(xù)稀釋后計(jì)數(shù)。

注意要點(diǎn)：

1、冷凍越慢越好，復(fù)蘇越快越好。

2、與液氮接觸的操作，注意戴保護(hù)眼鏡和手套。細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)，水浴中搖動(dòng)小瓶易爆炸。且DMSO為有毒致癌品，接觸時(shí)帶好手套。

3、凍存細(xì)胞數(shù)量要足夠，一般最低要達(dá)到5x10^6/ml。濃度視情況而定。

4、做好標(biāo)記：培養(yǎng)瓶上應(yīng)該用馬克筆做好標(biāo)記，寫(xiě)上細(xì)胞名稱、代數(shù)和凍存時(shí)間。

5、對(duì)剛復(fù)蘇的細(xì)胞動(dòng)作要輕柔，避免細(xì)胞破裂。

6、DMSO對(duì)大多數(shù)細(xì)胞不敏感，所以解凍之后不需要除去DMSO，解凍后頻繁換液會(huì)慢慢除去DMSO。部分對(duì)DMSO敏感的細(xì)胞需要除去DMSO。

7、解凍后的細(xì)胞要用和以前一樣的培養(yǎng)液和血清，突然換不一樣的培養(yǎng)液和血清會(huì)造成細(xì)胞生長(zhǎng)不良，甚至死亡。