細胞侵襲實驗總結(jié)！

實驗原理

將細胞小室（Transwell小室）放入培養(yǎng)板中，小室內(nèi)稱上室，培養(yǎng)板內(nèi)稱下室，上室內(nèi)盛裝上層培養(yǎng)液，下室內(nèi)盛裝下層培養(yǎng)液，上下層培養(yǎng)液以聚碳酸酯膜相隔。我們將細胞種在上室內(nèi)，由于聚碳酸酯膜有通透性，下層培養(yǎng)液中的成分可以影響到上室內(nèi)的細胞，從而可以研究下層培養(yǎng)液中的成分對細胞生長、運動等的影響。

細胞小室（transwell）

應(yīng)用不同孔徑和經(jīng)過不同處理的聚碳酸酯膜，就可以進行共培養(yǎng)、細胞趨化、細胞遷移、細胞侵襲等多種方面的研究。當(dāng)然不同細胞其體積不同，具體選擇時要考慮到細胞大小。

所應(yīng)有的常見實驗

共培養(yǎng)體系：

小于3.0?m孔徑條件下，細胞不會遷徙通過，因此，若研究不涉及細胞運動能力，不需要細胞穿過聚碳酸酯膜，則應(yīng)選擇3.0?m以下孔徑。常用0.4、3.0?m。我們實驗室用的是0.4?m。

將細胞A種于上室，細胞B種于下室，可以研究細胞B分泌或代謝產(chǎn)生的物質(zhì)對細胞A的影響。

趨化性實驗

可用5.0、8.0、12.0?m膜，上室細胞可穿過聚碳酸酯膜進入下室，計數(shù)進入下室的細胞量可反映下室成分對上室細胞的趨化能力。

①細胞B對細胞A的趨化作用：將細胞A種于上室，細胞B種于下室，可以研究細胞B分泌或代謝產(chǎn)生的物質(zhì)對細胞A的趨化作用。

②趨化因子對細胞的趨化作用：將細胞種于上室，下室加入某種趨化因子，可研究該趨化因子對細胞的趨化作用。

腫瘤細胞遷移實驗

常用8.0、12.0?m膜，上室種腫瘤細胞，下室加入FBS或某些特定的趨化因子，腫瘤細胞會向營養(yǎng)成分高的下室跑，計數(shù)進入下室的細胞量可反映腫瘤細胞的遷移能力。

腫瘤細胞侵襲實驗

常用8.0、12.0?m膜，原理與腫瘤細胞遷移實驗類似。

上室種腫瘤細胞，下室加入FBS或某些特定的趨化因子，腫瘤細胞會向營養(yǎng)成分高的下室跑，但與腫瘤細胞遷移實驗不同的是，聚碳酸酯膜上室側(cè)鋪上一層基質(zhì)膠，用以模仿體內(nèi)細胞外基質(zhì)，細胞欲進入下室，先要分泌基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）將基質(zhì)膠降解，方可通過聚碳酸酯膜。計數(shù)進入下室的細胞量可反映腫瘤細胞的侵襲能力。

侵襲實驗操作

實驗用品

細胞小室：

有很多不同規(guī)格，根據(jù)實驗需求自己選擇。

上層培養(yǎng)液：

上層培養(yǎng)液采用無血清培養(yǎng)基，為維持滲透壓，需加入0.05%-0.2% BSA。

細胞：

值得注意的是，有侵襲能力的細胞才可用于Transwell侵襲實驗。建議實驗前先用酶譜法檢測MMPs的表達，特別是MMP-2的表達。如果不清楚細胞MMPs的表達情況，就盲目進行Transwell侵襲實驗，可能會造成不必要的浪費，一次Transwell侵襲實驗花錢少則數(shù)百，多則數(shù)千，并不是筆小數(shù)目，還是小心為妙。

另外，為了讓實驗結(jié)果更明顯，可先撤血清讓細胞饑餓12－24h，再進行實驗。

基質(zhì)膠：

常用的是人工重構(gòu)基底膜材料Matrigel，主要成分為層黏連蛋白和Ⅳ型膠原，

如果購買的小室是已經(jīng)鋪好基質(zhì)膠的，那么Matrigel就不需要購買了。

下層培養(yǎng)液：

下層常用含5%－10% FBS的培養(yǎng)基，具體濃度根據(jù)細胞侵襲力而定，侵襲力弱的細胞可適當(dāng)提高FBS濃度。下層也可用趨化因子，有戰(zhàn)友將纖維粘連蛋白加入下層培養(yǎng)液作為趨化因子，但個人認為，F(xiàn)BS仍是最合適的。

細胞培養(yǎng)板：

常用于Transwell侵襲實驗的細胞培養(yǎng)板有6孔板、12孔板、24孔板等，以24孔最常用。細胞培養(yǎng)板沒什么特殊要求，普通的細胞培養(yǎng)板就可以。但要注意，細胞培養(yǎng)板應(yīng)當(dāng)與購買的Transwell小室相配套。


此外，膜的下室面可涂上纖維粘連蛋白，這樣做的目的是使穿過膜的細胞更好地附著在膜上，也可用膠原（collagen）或明膠（gelatin）。細胞照樣貼壁很好。如果貼壁不好的話可以試試看。如果培養(yǎng)時間很長（>24h），細胞還是會掉到下室里面去，所以有條件的話，最好還是在膜下層涂上FN。另外，值得一提的是，膜下層涂上FN還有一定的趨化作用。

實驗步驟

無基質(zhì)膠Transwell小室制備

① 包被基底膜：

用50mg/L Matrigel 1:8稀釋液包被Transwell小室底部膜的上室面，4℃風(fēng)干。如果需要在下室面鋪FN的話，可將200ul槍頭的尖端剪掉,吸取FN均勻涂抹在小室的下面。用膠原（collagen）的話，一般配成0.5mg/ml，直接用槍吸了涂在膜上。

② 水化基底膜：

吸出培養(yǎng)板中殘余液體，每孔加入50ul含10g/LBSA的無血清培養(yǎng)液，37℃，30min。

另有方法：在上室的聚碳酸酯膜上加入稀釋后的Matrigel (3.9?g/?l) 60-80?l (注意體積不可太大，以剛把聚碳酸酯膜浸濕為最好)，置37℃ 30min使Matrigel聚合成凝膠。

制備細胞懸液

① 制備細胞懸液前可先讓細胞撤血清饑餓12－24h，進一步去除血清的影響。但這一步并不是必須的。

② 消化細胞，終止消化后離心棄去培養(yǎng)液，用PBS洗1－2遍，用含BSA的無血清培養(yǎng)基重懸。調(diào)整細胞密度至1－10×105，個人認為不要超過5×105。

具體實驗時采用密度要自己摸索，因為不同細胞，其侵襲能力是不同的。個人經(jīng)驗，細胞量過多，穿過膜的細胞會過多過快，如果最后用計數(shù)法統(tǒng)計結(jié)果的話將難以計數(shù)；而過少的話，可能還沒到檢測的時間點，所有的細胞都已穿過，因此最少也要保證在收樣的時候，上室內(nèi)還要有一定量的細胞存在。

對照組和處理盡量不要分開計數(shù)，因為細胞數(shù)目的差異會嚴重影響實驗結(jié)果。如果需要對細胞預(yù)處理而不得不分開計數(shù)，那么計數(shù)一定要多重復(fù)幾次，力求準確，盡量保證對照組和處理組細胞密度一致。

接種細胞

①取細胞懸液100－200?l加入小室，不同公司的、不同大小的小室對細胞懸液量有不同要求，請參考說明書。24孔板小室一般200?l。

② 24孔板下室一般加入500?l含F(xiàn)BS或趨化因子的培養(yǎng)基，不同的培養(yǎng)板加的量有不同要求，具體請參考說明書。這里要特別注意的是，下層培養(yǎng)液和小室間常會有氣泡產(chǎn)生，一旦產(chǎn)生氣泡，下層培養(yǎng)液的趨化作用就減弱甚至消失了，在種板的時候要特別留心，一旦出現(xiàn)氣泡，要將小室提起，去除氣泡，再將小室放進培養(yǎng)板。

③ 培養(yǎng)細胞：常規(guī)培養(yǎng)12－48h（主要依癌細胞侵襲能力而定）。時間點的選擇除了要考慮到細胞細胞侵襲力外，處理因素對細胞數(shù)目的影響也不可忽視。

另外，我看到細胞在小室內(nèi)的形態(tài)不是正常培養(yǎng)貼壁的形態(tài)，而是圓形的，仍是懸浮時的形態(tài)，不過會聚集成團，所以看到細胞不正常貼壁也不要緊張，是正常現(xiàn)象。

在培養(yǎng)過程中，膜下會逐漸有少量小氣泡產(chǎn)生，這是正常現(xiàn)象，可不予處理，但我遇到過培養(yǎng)一段時間后，膜下出現(xiàn)了大氣泡，幸虧及時發(fā)現(xiàn)，否則后果將非常嚴重。因此，個人建議，最好接種細胞后1－2h把培養(yǎng)板從培養(yǎng)箱里拿出來看看，確信沒有大氣泡產(chǎn)生。

結(jié)果統(tǒng)計

檢測穿過的細胞數(shù)有兩種方法：

直接計數(shù)法

1、“貼壁”細胞計數(shù)

這里所謂的“貼壁”是指細胞穿過膜后，可以附著在膜的下室側(cè)而不會掉到下室里面去?？梢酝ㄟ^給細胞染色，可在鏡下計數(shù)細胞

① 用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細胞；

② 染色：常用的染色方法有結(jié)晶紫染色、臺靡藍染色、Giemsa染色、蘇木精染色、伊紅染色等。

③ 細胞計數(shù)：使用正置顯微鏡進行觀察和拍照，把Transwell小室反過來底朝上就可清楚看到小室底膜上下室側(cè)附著的細胞。也有不少人用手術(shù)刀將膜切下后染色，再貼在玻片上，滴二甲苯，再蓋上蓋玻片，就可以長期保存，但是這樣做小室就成了一次性的了，未免有點浪費。

取若干個視野計數(shù)細胞個數(shù)。一般采用3-5個視野，也有人用10個，都是隨機選取。

間接計數(shù)法

由于某些細胞自身的原因或某些膜的關(guān)系，有時細胞在穿過膜后不能附著在膜上，而是掉進下室。

間接計數(shù)法主要用于穿過細胞過多，而無法通過計數(shù)獲得準確的細胞數(shù)所采用的方法，與常用的MTT實驗是同樣的原理。

1、MTT法

① 用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細胞；

② 24孔板中加入500?l含0.5mg/ml MTT的完全培養(yǎng)基，將小室置于其中，使膜浸沒在培養(yǎng)基中，37℃ 4h后取出。

③ 24孔板中加入500?l DMSO，將小室置于其中，使膜浸沒在DMSO中，振蕩10min，使甲湃充分溶解。取出小室，24孔板于酶標儀上測OD值。

2、熒光試劑檢測

這類方法一般是與Transwell小室一起出售的，其原理與MTT法類似，是用一種熒光染料染細胞，再將細胞裂解，檢測熒光值。

3、結(jié)晶紫檢測

原理與MTT法也是類似的。但結(jié)晶紫染色還有個優(yōu)點，就是染色和脫色的過程并不影響膜上細胞，在脫色后還可重新染色。