質(zhì)粒轉(zhuǎn)化步驟

一.實(shí)驗(yàn)原理

質(zhì)粒可攜帶一種或多種抗生素抗性基因，其賦予攜帶它們的細(xì)菌對(duì)特定抗生素的抗性。研究人員可以通過(guò)人工選擇（即在抗生素存在下培養(yǎng)細(xì)菌），輕松地將含有該質(zhì)粒的細(xì)菌與不含有該細(xì)菌的細(xì)菌分離。

Luria肉湯（LB）是一種富含營(yíng)養(yǎng)的培養(yǎng)基，通常用于培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室中的細(xì)菌。向LB中添加瓊脂導(dǎo)致形成細(xì)菌可以生長(zhǎng)的凝膠，因?yàn)樗鼈儾荒芟傊梢詮腖B內(nèi)收集營(yíng)養(yǎng)。向該凝膠中添加抗生素只允許選擇那些對(duì)該抗生素具有抗性的細(xì)菌 - 通常由攜帶抗生素抗性基因的質(zhì)粒賦予。

LB瓊脂平板經(jīng)常用于分離攜帶特定質(zhì)粒的細(xì)菌的個(gè)體菌落。然而，液體培養(yǎng)物能夠支持更高密度的細(xì)菌，并用于培養(yǎng)足夠數(shù)量的細(xì)菌以分離足夠的質(zhì)粒DNA用于實(shí)驗(yàn)用途。

二.試劑及實(shí)驗(yàn)器材準(zhǔn)備

1.液體培養(yǎng)基配制：

胰蛋白胨Tryptone：10g

酵母粉Yeast：5g

NaCl：10g

dH2O定容至1000ml

2.LB平板配制:

胰蛋白胨Tryptone：10g

酵母粉Yeast：5g

NaCl：10g

瓊脂糖：12g（工作濃度6-25g/L）

dH2O定容至1000ml

3.無(wú)菌平板（不可高壓）：通常使用60 mm x 15 mm平板，200ml瓊脂澆筑4-5個(gè)平板（若瓊脂太少過(guò)夜孵育后容易干裂），可在其上單獨(dú)區(qū)分最多約100個(gè)菌落

4. Falcon細(xì)胞流式管（不可高壓）5.可高壓滅菌的燒瓶：（用1L瓶制備400ml瓊脂，在500ml瓶中制備200ml瓊脂，需要額外的空間防止沸騰。）

6.抗生素：1000倍的儲(chǔ)備溶液(氨芐青霉素鈉,庫(kù)存濃度100mg/ml，溶解后，0.22um過(guò)濾除菌，分裝，-20℃保存數(shù)月。加入培養(yǎng)基時(shí)一定要等滅菌后的培養(yǎng)基冷卻到40-50℃時(shí)再加入。含氨芐青霉素的培養(yǎng)基平板在4℃可保存2周。)
 

三.實(shí)驗(yàn)步驟

1.溶解質(zhì)粒： 將含目的基因質(zhì)粒的 紙剪下（比畫(huà)得圈稍大），并剪成碎片，放入無(wú)菌EP管，加20到50ul無(wú)菌水或TEbuffer， 可用槍頭將濾紙搗碎，室溫過(guò)夜（或?yàn)榱舜偃?，還可60℃水?。?。后漩渦振蕩5min，離心，取上清即為質(zhì)粒用于后續(xù)轉(zhuǎn)化。

2.LB液體培養(yǎng)基、LB平板粉末 攪拌溶解后，121℃高壓滅菌半小時(shí)，高壓滅菌過(guò)程中高壓釜膠帶會(huì)變暗。液體LB 無(wú)菌環(huán)境下冷卻至室溫，放置4℃冰箱備用；LB平板 熔融凝膠混合物在凝固前轉(zhuǎn)入40-50℃（視抗生素加入培養(yǎng)基溫度而定）水浴鍋，至少5分鐘，備用。

3.準(zhǔn)備培養(yǎng)皿、Falcon細(xì)胞流式管，紫外線(xiàn)消毒30min；（在培養(yǎng)皿上標(biāo)記日期、抗生素特性。）

4.準(zhǔn)備抗生素（要制備終濃度為100 ug/mL氨芐青霉素鈉的平板，則應(yīng)制備100,000 ug / mL（100 mg / mL）的儲(chǔ)備溶液。測(cè)量100毫克氨芐青霉素鈉粉末，將其加入1毫升水中，通過(guò)渦旋溶解，并過(guò)濾滅菌。）

5.添加抗生素至LB液體培養(yǎng)基、LB平板熔融凝膠混合物中（溫度不宜過(guò)高，40-50℃（視抗生素分解溫度而定，氨芐青霉素鈉加入溫度為40-50℃），防止抗生素分解）

6.澆筑LB平板：澆注后將盤(pán)子旋轉(zhuǎn)以除去氣泡，確保瓊脂在板底部均勻分布，凝固后倒置。200ml瓊脂澆筑4-5個(gè)平板（若瓊脂太少——板過(guò)薄，過(guò)夜孵育后容易干裂）若澆筑過(guò)程瓶中的瓊脂凝固，可再次通過(guò)高壓滅菌器或微波爐將瓊脂重新液化（用微波爐時(shí)防止沸騰?。┦覝叵鹿袒蠹s需要30min，在室溫下過(guò)夜使之干燥。在過(guò)夜干燥后，將板在4℃下（用PE手套包好）儲(chǔ)存直至使用。

7.取感受態(tài)細(xì)胞置于冰浴中，如需分裝可將剛?cè)诨?xì)胞懸液分裝到無(wú)菌預(yù)冷（提前冰上預(yù)冷1.5mlEp管）的離心管中，置于冰浴中。

注意：一次轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的建議用量為50-100ul，可以根據(jù)實(shí)際情況分裝。所用DNA體積不超過(guò)感受態(tài)細(xì)胞懸液體積的1/10。（根據(jù)加入質(zhì)粒體積提前準(zhǔn)備無(wú)菌10ul無(wú)濾芯槍頭）

8. 向感受態(tài)細(xì)胞懸液中加入目的DNA/ pUC19質(zhì)粒（對(duì)照：證實(shí)感受態(tài)細(xì)胞是否有問(wèn)題）（100ul的感受態(tài)細(xì)胞能夠被1ng超螺旋質(zhì)粒DNA所飽和)，輕彈混勻，在冰浴中靜置30min。

9. 將離心管置于42℃水浴中放置60-90s，然后快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻2-3min，該過(guò)程不要搖動(dòng)離心管。

注意：此步驟也可將離心管置于室溫進(jìn)行，夏季或室溫較高時(shí)，可放置5-8min， 如果室溫較低，可延長(zhǎng)時(shí)間至8-15min。條件允許建議使用42℃熱激方法。

10. 向每個(gè)離心管中加入900ul無(wú)菌的LB培養(yǎng)基 （不含抗生素），混勻后置于37℃搖床振蕩培養(yǎng)45 min (將1.5mlEp管水平放置，充分搖混勻)，目的是使質(zhì)粒上相關(guān)的抗性標(biāo)記基因表達(dá)，使菌體復(fù)蘇。

11. 將離心管內(nèi)容物混勻，吸取100ul （第一次涂板，可設(shè)置不同的梯度：20ul、50ul、70ul、100ul）已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞加到含相應(yīng)抗生素的LB固體培養(yǎng)基上，用無(wú)菌的彎頭玻棒輕輕的將細(xì)胞均勻涂開(kāi)。將平板置于室溫直至液體被吸收(15-20min)，倒置平板，37℃培養(yǎng)12-16h（過(guò)夜）。

注意：涂布用量可根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)來(lái)調(diào)整。如轉(zhuǎn)化的DNA總量較多，可取更少量轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布平板；反之，如轉(zhuǎn)化的DNA總量較少，可取200-300ul轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布平板。如果預(yù)計(jì)的克隆較少，可通過(guò)離心（4000rpm, 2min）后吸除部分培養(yǎng)液，懸浮菌體后將其涂布于一個(gè)平板中。（涂布剩余的菌液可置于4℃保存，如果次日的轉(zhuǎn)化菌落數(shù)過(guò)少可以將剩下的菌液再涂布新的培養(yǎng)板。）

12. 使用無(wú)菌槍頭或牙簽，從LB瓊脂平板上選擇一個(gè)菌落。

13. 將槍頭或牙簽放入液體LB +抗生素中并旋轉(zhuǎn)。

14. 將細(xì)菌培養(yǎng)物在37℃下在振蕩培養(yǎng)箱中 180rpm孵育12-18h。

15. 孵育后，檢查生長(zhǎng)，其特征在于培養(yǎng)基中的混濁霧度（見(jiàn)右圖）。

注意：良好的陰性對(duì)照是LB培養(yǎng)基+抗生素，沒(méi)有任何細(xì)菌接種。過(guò)夜孵化后，您應(yīng)該看到這種培養(yǎng)物沒(méi)有生長(zhǎng)。

對(duì)于細(xì)菌的長(zhǎng)期儲(chǔ)存，選擇甘油。

1、配制30%（體積分?jǐn)?shù)）的甘油水溶液,離心管若干滅菌備用.

2 、將細(xì)菌用富集培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)過(guò)夜,根據(jù)保藏要求（有些要求高的項(xiàng)目中菌要達(dá)到一定OD值）培養(yǎng).

3 、將菌液和滅菌的甘油水溶液按照2:1的體積比例在離心管中混勻（使最終甘油濃度為10%,其實(shí)甘油多點(diǎn)也沒(méi)關(guān)系）,-70°冰箱保存.

16. 用小提試劑盒從大腸桿菌培養(yǎng)物中分離質(zhì)粒DNA。

17. 樣品進(jìn)行電泳檢測(cè)：1%瓊脂糖凝膠電泳，上樣量為2ul，紫外燈下觀(guān)察，最明亮的帶為超螺旋形式，可以在一定程度上表明提取質(zhì)粒的純度。

18. 質(zhì)粒純化

1) 將之前提取好的質(zhì)粒放入1.5ml離心管中，加入1/10體積的3mol/L無(wú)菌乙酸鈉溶液。

2) 加入2倍體積的無(wú)水乙醇，放置于-20℃沉淀4-6h或過(guò)夜。

3) 4℃，高速離心機(jī)14000rpm，離心20min.

4) 棄去上清，70%乙醇洗2次。

5) 空氣干燥，可置超凈工作臺(tái)干燥。

6) 加200ul無(wú)菌水溶液干燥后所得沉淀，即為質(zhì)粒溶液。

7) 紫外分光光度計(jì)測(cè)量質(zhì)粒濃度和產(chǎn)量。

四.提示和常見(jiàn)問(wèn)題

(1)高拷貝質(zhì)粒和低拷貝質(zhì)粒有什么區(qū)別？

拷貝數(shù)是指單個(gè)細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)單個(gè)質(zhì)粒的拷貝數(shù)。大質(zhì)粒通常具有低拷貝數(shù)（每個(gè)細(xì)胞大約一個(gè)或兩個(gè)拷貝）并且它們需要生長(zhǎng)更長(zhǎng)的時(shí)間段（大約18-30小時(shí)）。另一方面，較小的質(zhì)粒可以大量存在，每個(gè)細(xì)胞50個(gè)或更多，并且具有高拷貝數(shù)。高拷貝數(shù)質(zhì)粒應(yīng)該僅需要平均生長(zhǎng)12-16小時(shí)。無(wú)論質(zhì)粒大小如何，質(zhì)粒的某些特征可使其低拷貝。請(qǐng)參閱質(zhì)粒的信息頁(yè)面以確定您的質(zhì)粒是高拷貝還是低拷貝。

(2)過(guò)夜孵化后，我沒(méi)有任何增長(zhǎng)。什么地方出了錯(cuò)？

嘗試將文化培養(yǎng)更多時(shí)間。一些細(xì)菌培養(yǎng)物生長(zhǎng)得更慢。此外，在30°C而不是37°C溫育的細(xì)菌通常需要更長(zhǎng)的孵育時(shí)間。

仔細(xì)檢查LB培養(yǎng)基中的抗生素是否與質(zhì)粒上的抗生素抗性相匹配。

如果LB瓊脂平板上的細(xì)菌不是新鮮的，你應(yīng)該將細(xì)菌劃到新的LB瓊脂平板上，然后在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。

更多的曝氣可能有助于增加培養(yǎng)物的密度。通常培養(yǎng)物在150-250rpm下?lián)u動(dòng)，將其增加至350-400rpm以獲得更高的細(xì)胞密度。