新手入門：質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化，滿滿干貨

原理：在受體細(xì)胞經(jīng)過化學(xué)試劑或者電擊處理等方法處理后，受體細(xì)胞的膜通透性發(fā)生改變，質(zhì)粒DNA或者以其為載體的重組DNA分子，進(jìn)入到細(xì)菌體內(nèi)而實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增。

感受態(tài)細(xì)胞：是指細(xì)胞自然或者經(jīng)過誘導(dǎo)處于容易吸收外源DNA的一種生理狀態(tài)。在基因工程中，用于轉(zhuǎn)化的受體菌（Restriction-Modification 缺陷變異株，以防止對(duì)導(dǎo)入外源DNA進(jìn)行切割）一般通過誘導(dǎo)的方式實(shí)現(xiàn)。主要原理就是通過處理使細(xì)胞的通透性變大，直觀的說，使得細(xì)胞膜表面出現(xiàn)一些孔洞，便于外源基因或載體進(jìn)入感受態(tài)細(xì)胞。由于細(xì)胞膜的流動(dòng)性，這種孔洞會(huì)被細(xì)胞自身所修復(fù)。
質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化主要包含：

Ⅰ感受態(tài)細(xì)胞制備

Ⅱ質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化

Ⅲ質(zhì)粒DNA的提取

（Ⅰ）感受態(tài)細(xì)胞制備

1）從新活化的大腸桿菌（常用DH5a）平板上挑取一個(gè)單菌落，接種于3ml LB培養(yǎng)基的試管中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。

2）將該菌懸液按照1:100轉(zhuǎn)接到液體培養(yǎng)基中，100ml，37℃振蕩擴(kuò)大培養(yǎng)，2~3h。當(dāng)培養(yǎng)液開始渾濁時(shí)，間段性測(cè)試OD600，在數(shù)值為0.3-0.5時(shí)停止培養(yǎng)。

3）培養(yǎng)好的菌液轉(zhuǎn)移到離心管中，冰上放置20min，0℃-4℃離心10min（4000r/min）。

4）棄掉上清，管口倒置以便培養(yǎng)液棄除干凈。

5）加入0.1mol/L冰冷的氯化鈣溶液30ml，小心懸浮沉淀細(xì)胞，冰浴30min。（氯化鈣的濃度和純度非常重要，不同批次不同廠家的產(chǎn)品均可影響感受態(tài)轉(zhuǎn)化率）

6）4℃離心10min（4000r/min）。

7）棄掉上清，用0.1mol/L氯化鈣2ml冰浴懸浮細(xì)胞（冰上放置）片刻，感受態(tài)細(xì)胞制成。

8）可直接用于實(shí)驗(yàn)，4℃保存。也可分裝長(zhǎng)期保存，加入總體積15%的滅菌甘油，-70℃條件下保存。

（Ⅱ）質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化

1）取100ul新鮮制備的感受態(tài)細(xì)胞，加入質(zhì)粒1ul DNA混勻,同時(shí)設(shè)置對(duì)照組（未加質(zhì)粒，未加受體菌，已知具有轉(zhuǎn)化活性的DNA）。

冷凍的感受態(tài)細(xì)胞要在冰上解凍，待管中最后一點(diǎn)冰融化后，迅即加入DNA. 解凍感受態(tài)細(xì)胞溫度高于0℃，會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率。

2）冰浴30min，離心管放到42℃保溫90s（不要搖動(dòng)離心管）。冰浴時(shí)間短于30min ,可能影響轉(zhuǎn)化率。然后迅速冰浴2min。

3）向離心管加800ulLB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1h（150r/min）。37℃生長(zhǎng)1小時(shí)能夠?qū)τ诩?xì)胞恢復(fù)和抗生素抗藥性表達(dá)具有最佳效果。

4）取適當(dāng)（50ul）的復(fù)蘇細(xì)胞培養(yǎng)液，涂布在含抗性的選擇性培養(yǎng)基上，將培養(yǎng)皿放置在37℃恒溫培養(yǎng)箱中，正置30min。等菌液完全被培養(yǎng)基吸收后，倒置培養(yǎng)皿，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)12~16h，出現(xiàn)菌落。

5）菌落結(jié)果：

① 無菌落

失敗或者培養(yǎng)條件不充分

② 布滿菌落,

呈苔樣，失敗?？赡苁强股貪舛炔粔蚧蚴　３霈F(xiàn)大菌斑，大多是由于霉菌污染所致

③ 布滿菌落

濃度太高，失敗

④ 出現(xiàn)菌落

符合要求

Ⅲ）質(zhì)粒DNA的提取

質(zhì)粒DNA的提取，由于其本身分子量小，一般采用堿裂解法提取。目前已研發(fā)出多種質(zhì)粒提取試劑盒，實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單，只需按照產(chǎn)品操作說明操作即可。不過對(duì)于其中主要試劑和作用的理解，能夠避免實(shí)驗(yàn)過程中的一些問題，或者能夠更好的解決問題。