怎么建穩(wěn)轉(zhuǎn)株才能真的穩(wěn)？

    穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，即進(jìn)入細(xì)胞的質(zhì)粒整合入細(xì)胞基因組中，并能隨細(xì)胞分裂穩(wěn)定傳遞下去。這是相對(duì)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染而言的。

    瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的表達(dá)時(shí)間短暫，外源基因?qū)胝匣蚪M的幾率非常低，絕大部分以游離形式存在，不能隨細(xì)胞分裂而一同復(fù)制，導(dǎo)致最后拷貝數(shù)被稀釋，無(wú)法達(dá)到持續(xù)表達(dá)外源基因的目的。一般用轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，多為瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。

    一般如下情況需要構(gòu)建穩(wěn)定株

    1. 長(zhǎng)期在目的細(xì)胞中研究基因功能，通過(guò)構(gòu)建穩(wěn)定株，可以大大降低頻繁轉(zhuǎn)染或者病毒包裝的成本，也極大方便實(shí)驗(yàn)研究；

    2. 部分蛋白半衰期極長(zhǎng)，瞬時(shí) RNA 只能干擾表達(dá)，無(wú)法去除已經(jīng)表達(dá)的目的蛋白，通過(guò)構(gòu)建穩(wěn)定株可以實(shí)現(xiàn)更好的基因干擾效果；

    3. 瞬轉(zhuǎn)往往會(huì)引入極高拷貝數(shù)的表達(dá)，導(dǎo)致因?yàn)槿藶橐蛩卦斐蓪?shí)驗(yàn)結(jié)果的不精確，構(gòu)建穩(wěn)定株可以幫助篩選拷貝數(shù)適量的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究；

    4. 需要用誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的，主要是一些致死基因或者是需要時(shí)空表達(dá)的；

    5. 需要用細(xì)胞做動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的，比如裸鼠成瘤等，往往需要構(gòu)建成穩(wěn)轉(zhuǎn)株。

    構(gòu)建穩(wěn)定株的方法

    其實(shí)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、磷酸鈣轉(zhuǎn)染法等理論上是可以構(gòu)建穩(wěn)定株的，但這些方法整合入基因組的效率極低，很難成功。而慢病毒可以攜帶外源基因隨機(jī)整合進(jìn)基因組，效率很高，是建立穩(wěn)定株的最優(yōu)方式。



    構(gòu)建穩(wěn)定株的注意點(diǎn)

    穩(wěn)定株構(gòu)建是個(gè)長(zhǎng)期過(guò)程，從質(zhì)粒構(gòu)建到慢病毒包裝，再到細(xì)胞感染及后期的篩選，每一步都至關(guān)重要，所以建立穩(wěn)轉(zhuǎn)株花個(gè)半年時(shí)間，也是常有的事，而且要承擔(dān)病毒包裝不成功，細(xì)胞感染效率低等風(fēng)險(xiǎn)。