長片段PCR擴(kuò)增中幾個(gè)常見問題的解決辦法

1. 當(dāng)PCR結(jié)果不滿意時(shí),考慮以下幾個(gè)方面
(1)將PCR反應(yīng)的試管與反應(yīng)板緊貼,
(2)使用50ul或更少反應(yīng)體系時(shí),勿使用AmpliWax,兩個(gè)反應(yīng)混合液=的操作方式在大多數(shù)情況下很有效,
(3)當(dāng)酶反應(yīng)混合物以70度"熱啟動"開始循環(huán)時(shí),切記在加入酶后稍微振蕩一下,因?yàn)樵?.2ml的PCR管不能均勻傳熱.
(4)不要隨意減少dNTP的用量,必需與其他成分保持平衡.
2. 沒有擴(kuò)增產(chǎn)物
1)在提供氯化鎂緩沖液中,以0.25mmol/L為梯度增加氯化鎂濃度,
(2)泳道中出現(xiàn)模糊條帶,如果DNA模板中存在RNA,按上訴提示濃度補(bǔ)加氯化鎂,因?yàn)樵赑CR反應(yīng)中可能缺少游離的鎂離子.
(3)在融化試劑時(shí),將第三緩沖液在15-25度溫育后混勻,若還有晶體狀物質(zhì),放置過夜混勻后可再次使用.
(4)檢查退火溫度和變性條件,如果需要可降低退火溫度.
(5)檢查模板和引物的用量.增加循環(huán)次數(shù)和/或模板DNA的用量.

3. 泳道中出現(xiàn)模糊條帶
(1)減少循環(huán)次數(shù)或模板DNA的用量,
(2)提高退火溫度,單不要超過68度,
(3)重新設(shè)計(jì)引物或設(shè)計(jì)更長的引物.

4. 其他值得注意的條件
1)建議使用0.2ml的薄壁管,因?yàn)楹癖诠茉?2度時(shí)不能有效的使模板變性.
(2)最佳反應(yīng)體積為50ul,最好泳30ul礦物油覆蓋,
(3)在大多數(shù)反應(yīng)中,0.75ul(0.5-1.0ul)的酶量可以得到滿意的結(jié)果,
(4)建議使用1.75mmol/L氯化鎂:350mmol/LdNTP或2.25mmol/L氯化鎂:500LNTP組合的混合物,要得到最佳結(jié)果,優(yōu)化鎂離子的濃度是必需的.
(5)基因組DNA模板的質(zhì)量顯著影響PCR反應(yīng),因此最好泳瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的長度.DNA片段長度可以超過50KB,傳統(tǒng)的基因組DNA能擴(kuò)增片段至10KB,要擴(kuò)增更長的片段應(yīng)使用超純或高分子量的DNA.
(6)降低二級結(jié)構(gòu)和引物二聚物形成的可能性.進(jìn)行長片段PCR擴(kuò)增時(shí),引物長度一般為24-34個(gè)核苷酸,熔點(diǎn)在63-68度之間,使用這類引物可提高PCR反應(yīng)的退火溫度來增加反應(yīng)的特異性,這點(diǎn)非常重要,長片段擴(kuò)增的效果往往受到非特異性短片度優(yōu)先擴(kuò)增的影響,變性:第一步變性在92-94度下進(jìn)行2分鐘,在循環(huán)過程中盡可能減少變性時(shí)間(92-94度下19秒),除非模板中富含GC,則95度下變性30秒,這可以防止DNA脫平嘌呤核鏈斷裂,對于需擴(kuò)增的基因組DNA片段終長度超過12KB時(shí),應(yīng)盡可能降低變性溫度.
(7)延伸:68度下進(jìn)行延伸.
(8)循環(huán)延伸:盡量采用循環(huán)延伸的條件,若PCR儀無此功能,則必需增加延伸的時(shí)間.
(9)長片段PCR系統(tǒng)擴(kuò)增的片段其3'-末端油一個(gè)突出的A,因此建議采用T/A克隆.若進(jìn)行平端克隆,可用Klenow酶或T4DNA多聚酶將PCR產(chǎn)物補(bǔ)平后在進(jìn)行.
(10)測序時(shí)因酶的混合物帶有3'-5'外切酶活性,用Sanger方法進(jìn)行測序不能產(chǎn)生均一的(染色體)帶型.