動物組織細胞基因組DNA提取 遠慕實驗√

一、實驗原理

真核生物的一切有核細胞（包括培養(yǎng)細胞）都能用來制備基因組 DNA.真核生物的DNA是以染色體的形式存在于細胞核內(nèi)，因此，制備DNA的原則是既要將DNA與蛋白質(zhì)、脂類和糖類等分離，又要保持DNA分子的完整。提取DNA的一般過程是將分散好的組織細胞在含SDS（十二烷基硫酸鈉）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白質(zhì)，再用酚和氯-仿/異戊-醇抽提分離蛋白質(zhì)，得到的DNA溶液經(jīng)乙醇沉淀使DNA從溶液中析出。

蛋白酶K的重要特性是能在SDS和EDTA（乙-二胺四乙酸二鈉）存在下保持很高的活性。在勻漿后提取DNA的反應(yīng)體系中，SDS可破壞細胞膜、核膜，并使組織蛋白與DNA分離，EDTA則抑制細胞中Dnase的 活性；而蛋白酶K可將蛋白質(zhì)降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分離出來。

二、儀器及試劑

1. 儀器：

恒溫水浴鍋、臺式離心機、紫外分光光度計（GeneQuant）、移液器、玻璃勻漿器、離心管（滅菌）、吸頭（滅菌）

2. 試劑：

（1）細胞裂解緩沖液：

Tris （pH8.0） 100 mmol/L

EDTA （pH 8.0） 500 mmol/L

NaCL 20 mmol/L

SDS 10%

胰RNA酶 20ug/ml

（2） 蛋白酶K：稱取20mg蛋白酶k溶于1ml滅菌的雙蒸水中，-20℃?zhèn)溆谩?br>
（3）TE緩沖液（pH 8.0）：高壓滅菌，室溫貯存。

（4）酚，氯-仿，異戊-醇（25:24:1）。

（5）異丙-醇、冷無水乙醇、70%乙醇、滅菌水。

三、操作步驟

1. 取新鮮或冰凍動物組織塊0.1g（0.5cm3），盡量剪碎。置于玻璃勻漿器中，加入1ml的細胞裂解緩沖液勻漿至不見組織塊，轉(zhuǎn)入1.5ml 離心管中，加入蛋白酶K （500ug/ml）20μl，混勻。在65℃恒溫水浴鍋中水浴30min，也可轉(zhuǎn)入37℃水浴12-24h，間歇振蕩離心管數(shù)次。于臺式離心機以12000 rpm離心5min，取上清液入另一離心管中。

2.加2倍體積異丙-醇，倒轉(zhuǎn)混勻后，可以看見絲狀物，用100μl 吸頭挑出，涼干，用200μlTE 重新溶解。（可進行PCR反應(yīng)等，需要進一步純化的按下列步驟進行。）

3.加等量的酚，氯-仿，異戊-醇（25:24:1）、振蕩混勻，離心12000 rpm，5min。

4.取上層溶液至另一管，加入等體積的氯-仿，異戊-醇（24：1），振蕩混勻，離心12000 rpm，5min。

5. 取上層溶液至另一管，加入1/2體積的7.5mol/L乙酸氨加入2倍體積的無水乙醇，混勻后室溫沉淀2min ，離心12000 rpm ，10min。

6.小心倒掉上清液，將離心管倒置于吸水紙上，將附于管壁的殘余液滴除掉。

7.用1ml 70%乙醇洗滌沉淀物1次，離心12000 rpm，5min。

8.小心倒掉上清液，將離心管倒置于吸水紙上，將附于管壁的殘余液滴除掉，室溫干燥。

9.加200ul TE重新溶解沉淀物，然后置于4℃或-20℃保存?zhèn)溆谩?br>
10.吸取適量樣品于GeneQuant上檢測濃度和純度。