抗生素檢定用芽孢懸液的制備及注意事項

管碟法是國內(nèi)外常用的抗生素微生物檢定法，利用管碟法測定抗生素效價，具有準確、直觀、重復性好等優(yōu)點，因而被廣泛采用。但是整個試驗過程中影響結(jié)果的因素很多，任何一個環(huán)節(jié)操作不當或者忽略就會造成很大誤差，導致整組試驗失敗。其中，芽孢懸液的制備就有很多需要注意的地方。

在用管碟法檢定抗生素時，需要將菌懸液與培養(yǎng)基混合均勻、覆蓋在底層培養(yǎng)基上，以形成抑菌圈。其中，對于菌懸液的制備要求為：

將所用菌的斜面培養(yǎng)物用 1～2 ml 滅菌水洗下，形成菌懸液;將菌懸液在營養(yǎng)瓊脂平皿上均勻涂布，置于 35～37℃ 條件下培養(yǎng) 7 天;涂片、染色，鏡檢芽孢率 ≥ 85% 時，用 10 ml 滅菌水將芽孢和菌體的混合物洗下，制成懸液;65℃ 水浴加熱 30 min，殺死菌體，形成有活性的芽孢懸液;冷卻、冰箱中保存?zhèn)溆谩?
根據(jù)實際操作中的經(jīng)驗，對這一環(huán)節(jié)需要注意的事項總結(jié)如下：

1 應該嚴格按照標準操作，將涂好的平皿連續(xù)培養(yǎng) 7 天再洗脫芽孢，這樣也有助于芽孢懸液的均一性，避免由于操作標準不一造成的試驗結(jié)果的偏差。有文章報道，將平板培養(yǎng)至 2、3、4、5、6 天與培養(yǎng)至第七天，制成的懸液在抗生素效價測定中無差異;但本人在實際試驗中發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng) 3 天的短小芽孢菌，鏡檢時芽孢率<80%, 并且平皿一旦從培養(yǎng)箱中拿出來，室溫放置至第 10 天，芽孢率也不會再發(fā)生明顯變化，這顯然不符合《中國獸藥典》規(guī)定的芽孢率 ≥ 85% 的要求。

2 試驗菌的菌齡對抑菌圈有一定影響。故檢定時應保持菌種及菌液的新鮮。一般菌種一月轉(zhuǎn)種一次，冰箱冷藏保存。對易變異的菌株，如藤黃微球菌等在制備菌懸液前進行單菌分離;其他菌株可半年分離一次。

3 試驗菌傳代最好不超過 5 次，以防止菌種老化變異。芽孢桿菌培養(yǎng)物用滅菌水洗下后，應在 65℃ 加熱 30 分鐘，使菌體的菌齡一致(有資料顯示可 70～75℃ 水浴 30 min 殺死菌體)。

4 加入菌懸液的體積，一般不少于 0.3 ml，并且不大于上層培養(yǎng)基體積的 1%(有資料說不大于 2%)。如果加入菌懸液的體積過小，則在同次實驗中，不同次加入菌懸液的體積相差較大， 造成實驗誤差;如果加入菌懸液的體積過大，則會使上層培養(yǎng)基變稀，并且因菌懸液的溫度較低，加至培養(yǎng)基中可能造成培養(yǎng)基結(jié)塊，影響測定結(jié)果。對于加入菌懸液體積的控制，可通過調(diào)節(jié)菌懸液的濃度來實現(xiàn)。