遠慕技術(shù)：質(zhì)粒提取實驗步驟

實驗原理

現(xiàn)在較常用的質(zhì)粒提取方法有三種:堿裂解法、煮沸法和去污劑裂解法，前兩種方法較為劇烈，適用于較小的質(zhì)粒（＜15Kb），而去污劑裂解法則比較溫合，一般用于分子量較大的質(zhì)粒（＞15Kb）。

堿裂解法是一種最廣泛使用的制備質(zhì)粒DNA的方法。其原理為：染色體DNA遠大于質(zhì)粒DNA，且染色體DNA為線狀分子，而質(zhì)粒為共價閉合環(huán)狀分子。當pH值為 12.0-12.6，堿性環(huán)境中，線性的大分子的染色體DNA完全變性且無法復性，而共價閉環(huán)質(zhì)粒DNA在將PH調(diào)至中性后即可恢復其天然構(gòu)象；在高鹽濃度存在的條件下，染色體DNA和蛋白質(zhì)在去污劑SDS的作用下形成沉淀，而質(zhì)粒DNA為可溶狀態(tài)，通過離心可除去大部分細胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質(zhì)，質(zhì)粒DNA仍在上清中。殘留的雜質(zhì)可以通過酚氯仿處理掉。

實驗過程

1、實驗試劑

（1）溶液Ⅰ 50mMl 葡萄糖 / 10mMl EDTA / 25mMl Tris-HCl,pH=8.0；

（2）溶液Ⅱ 0.2Ml NaOH / 1% SDS；

（3）溶液Ⅲ 3Ml 醋酸鉀 / 2Ml 醋酸；

（4）異丙醇，無水乙醇，75%乙醇應放-20℃冰箱預冷備用；

酚氯仿放4℃冰箱預存；

（5）搖菌，2-3ml相應抗性的LB培養(yǎng)液，在37℃溫度下過夜培養(yǎng)。

2、質(zhì)粒提取

（1）菌液12000rcf離心5min，棄掉上清，加入0.2ml溶液I（已加入RNase），充分混勻后，加入0.25ml溶液II，顛倒混勻，室溫放置5min，加入0.4ml 溶液III，顛倒混勻后，13000rcf 離心30min。

（2）上清轉(zhuǎn)入新的1.5mlEP管中，加入等體積的酚氯仿混合液，充分混勻。10000rcf 離心10min。

（3）取上清，轉(zhuǎn)入新的EP管，加入等體積、預冷的異丙醇，充分混勻后，13000rcf 離心 6min。

（4）倒掉上清液，用1ml預冷的75%乙醇，顛倒后，13000rcf 離心 1min。

（5）倒掉上清液，沿壁加入1ml預冷的75%乙醇，直接倒掉。

（6）沿壁加入1ml預冷的乙醇，直接倒掉。倒扣5min后，室溫下放置10min。

待管內(nèi)液體會發(fā)干凈后，向管內(nèi)加入100ul水，55℃孵育5min。

（7）所得質(zhì)粒溶液可以放入-20℃中長期保存。

注意事項

1. 若菌株為革蘭氏陽性菌，該菌有一層細胞壁，必須加入溶菌酶才能使之溶解。
2. 搖床速度不宜過高。達到OD600 1.5即可。
3. 溶液I加入RNase后需要放在4℃中保存，以防酶失活。
4. 溶液II和溶液III使用前需注意觀察是否有沉淀，如有沉淀可37℃水浴處理。
5. 溶液II處理菌體時間應控制在5分鐘以內(nèi)。

常見問題及解決方法