ATPase染色液(鈣鈷法)實(shí)驗(yàn)步驟

2020-05-29 14:05 來源：上海遠(yuǎn)慕生物試劑

產(chǎn)品名稱：ATPase染色液(鈣鈷法)
供應(yīng)商：遠(yuǎn)慕生物
規(guī)格：5×50ml
保存：4℃,避光,6個(gè)月

三磷酸腺苷酶( adenosine triphosphatase，ATPase)是一種水解酶，是催化ATP合成的一種酶。三磷酸腺苷酶根據(jù)所用激活劑、抑制劑以及酶定位的不同分為膜性三磷酸腺苷酶、肌球蛋白三磷酸腺苷酶、線粒體三磷酸腺苷酶等。ATPase能水解三磷酸腺苷為磷酸腺苷和磷酸，此酶只作用于磷酸與磷酸之間的高能鍵，因而釋放大量能量。其催化反應(yīng)如下：A-P-P-P + H2O→A-P-P + H3PO4 +能量
ATPase染色(鈣鈷法)原理在于三磷酸腺苷酶水解三磷酸腺苷為二磷腺苷和磷酸，磷酸根與鈣離子結(jié)合為磷酸鈣沉淀，再依次被置換為磷酸鈷和硫化鈷，最終產(chǎn)物為黑色硫化鈷沉淀。

產(chǎn)品組成：
名稱：Storage
規(guī)格：5×50ml
試劑(A): 鈣鹽溶液       50ml        RT 避光
試劑(B): ATPase孵育液       50ml        4℃ 避光
試劑(C): 硝酸鈷溶液     50ml        RT
試劑(D): 中性福爾馬林       50ml        RT
試劑(E): ALP硫化溶液        2×1ml      RT 避光
試劑(F): ATPase對(duì)照液       10ml        4℃ 避光
使用說明書      1份

自備材料:
1、蒸餾水
2、恒溫箱

操作步驟(僅供參考)：
(一)石蠟切片染色
1、石蠟切片脫蠟后，入蒸餾水。
2、入鈣鹽溶液中，37℃溫箱5min。
3、入ATPase孵育液，孵育2～4h。
4、蒸餾水洗1min。
5、入硝酸鈷溶液5min，入蒸餾水。
6、入中性福爾馬林，室溫固定2min。
7、流水沖洗2min。
8、在上述過程中配制ALP硫化工作液，即取試劑(E)用蒸餾水稀釋50倍, 即為ALP硫化
工作液，即配即用。切片入硫化工作液，孵育2min。
9、流水洗10min后，入蒸餾水。
10、石蠟切片經(jīng)95%乙醇溶液及無水乙醇脫水。
11、二甲苯透明，樹膠封片。

(二)冰凍切片染色
1、冰凍切片直接入蒸餾水。
2、入鈣鹽溶液中，37℃溫箱5min。
3、入ATPase孵育液，孵育40min。
4、蒸餾水洗1min。
5、入硝酸鈷溶液5min，入蒸餾水。
6、入中性福爾馬林，室溫固定2min。
7、流水沖洗2min。
8、在上述過程中配制ALP硫化工作液，即取試劑(E)用蒸餾水稀釋50倍, 即為ALP硫化
工作液，即配即用。切片入硫化工作液，孵育2min。
9、流水洗10min后，入蒸餾水。
10、甘油明膠封固。

染色結(jié)果：
酶所在陽(yáng)性部位黑色硫化鈷沉淀

陰性對(duì)照(可選)：
1、取對(duì)照切片，用試劑(F)-ATPase對(duì)照液進(jìn)行孵育，并與用ATPase孵育液孵育的切片進(jìn)
行比較。兩者反應(yīng)相同部位可能有非特異性磷酸(單酯)酶存在，兩者不同部位才是ATP酶活
性所在。
2、將切片入80℃蒸餾水10min，再與其他組織切片同時(shí)孵育，結(jié)果應(yīng)為陰性。

注意事項(xiàng)：
1、 ALP孵育液、ALP硫化液易失效，最好分成小分儲(chǔ)存，一經(jīng)開啟立即使用。
2、 ALP硫化液具有腐蝕性和刺激性氣味，應(yīng)小心操作。
3、對(duì)冰凍切片染色時(shí)，應(yīng)減少切片在室溫暴露的時(shí)間。
4、為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

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