抗壞血酸含量測定( 2,6 一二氯酚靛酚法)實(shí)驗(yàn)

一、目的
學(xué)習(xí)維生素 C 的生理功能和性質(zhì)，掌握用 2 ， 6 一二氯酚靛酚法測定維生素 C 的原理和方法。

二、原理
維生素 C 是一種水溶性維生素，是人類營養(yǎng)中最重要的維生素之一，人體缺乏維生素 C 時(shí)會出現(xiàn)壞血病，因此它又被稱為抗壞血酸。此外維生素 C 還具有預(yù)防和治療感冒以及抑制致癌物質(zhì)產(chǎn)生的作用。
維生素 C 的分布很廣，尤其在水果（如彌猴桃、橘子、檸檬、山楂、袖子、草莓
等）和蔬菜（莧菜、芹菜、青椒、菠菜、黃瓜、番茄等）中的含量更為豐富。
不同栽培條件、不同成熟度和不同的加工貯藏方法，都可以影響水果、蔬菜的抗壞血酸含量。測定抗壞血酸含量是了解果蔬品質(zhì)高低及其加工工藝成效的重要指標(biāo)。

維生素 C 在金屬銅和抗壞血酸氧化酶存在下極易氧化，因此，在用銅制品做食品時(shí)，維生素 C 易丟失。此外在堿性溶液中，維生素 C 也易被破壞，而在酸性溶液中比較穩(wěn)定。利用它具有的還原性質(zhì)可測定其含量。還原型抗壞血酸能被染料 2 ， 6- 二氯酚靛酚氧化為脫氫型，該染料在堿性溶液中呈藍(lán)色，在酸性溶液中呈紅色，被還原后變?yōu)闊o色。因此用 2 ， 6 一二氯酚靛酚滴定含有維生素 C 的酸性溶液時(shí)，維生素 C 尚未全部被氧化時(shí)，則滴下的染料立即使溶液變成粉紅色，當(dāng)溶液中的抗壞血酸全部被氧化成脫氫抗壞血酸時(shí)，滴入的 2 ， 6 一二氯酚靛酚立即使溶液呈現(xiàn)淡紅色。用這種染料滴定抗壞血酸至溶液呈淡紅色為滴定終點(diǎn)，根據(jù)染料消耗量即可計(jì)算出樣品中還原型抗壞血酸的含量。




三、儀器、試劑和材料
1 .儀器
（ 1 ）天平
（ 2 ）組織搗碎機(jī)
（ 3 ）微量滴定管（ 5ml)
（ 4 ）容量瓶（ 50ml)
（ 5 ）刻度吸管（ 5 ml, 10 ml )
（ 6 ）錐形瓶（ 100ml)


2 .試劑
（ 1 ） 1% 草酸溶液：草酸 1g 溶于 l00ml 蒸餾水中
（ 2 ） 2 ％草酸溶液：草酸 2g 溶于 l00ml 蒸餾水中
（ 3 ）壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（ 0. 1 mg/ ml) : 精確稱取 l0mg 純抗壞血酸（應(yīng)為潔白色，如變?yōu)辄S色則不能用）用 1 ％草酸溶液溶解并定容至 l00ml 。此溶液應(yīng)貯存于棕色瓶中，最好臨用前配制。
（ 4 ） 0 . 05 ％ 2,6 一二氯酚靛酚溶液：稱取 500mg 2, 6- 二氯酚靛酚溶于 300ml 含 104 mg 碳酸氫鈉（ A. R ）的熱水中，冷卻后用蒸餾水稀釋至 1000ml ，濾去不溶物，貯存于棕色瓶中， 4''C 冷藏可穩(wěn)定一周，臨用前以標(biāo)準(zhǔn)抗壞血酸標(biāo)定。
3 .材料
新鮮水果或蔬菜


四、操作步驟
1 .提取抗壞血酸
取新鮮水果或蔬菜 50g, 加入 50ml2 ％草酸溶液，用組織搗碎機(jī)打成勻漿。過濾取得濾液，濾餅可用少量 2 ％的草酸洗幾次，合并濾液，記錄濾液體積。
2 . 2 ， 6 一二氯酚靛酚溶液的標(biāo)定
準(zhǔn)確吸取 4 . Oml 抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)液（含 0 . 4g 抗壞血酸）于 l00ml 錐形瓶中，加 16ml 1 ％草酸溶液，用 2 ， 6 一二氯酚靛酚滴定至淡紅色（ 15 秒內(nèi)不褪色即為終點(diǎn)）。記錄所用染料溶液的體積，計(jì)算出 l ml 染料溶液所能氧化抗壞血酸的量。
3 .樣品滴定
準(zhǔn)確吸取樣品提取液兩份，各 20ml ，分別放入兩個(gè) 100ml 錐形瓶中，滴定方法同 2 中的操作，另取 20ml 1 ％草酸作空白對照滴定。


五、結(jié)果處理
取兩份樣品滴定所耗用染料體積的平均值，代入下式計(jì)算 100g 樣品中還原型抗壞血酸的含量：
V 1 為滴定樣品所耗用的染料的平均毫升數(shù)；
V 2 為滴定空白對照所耗用的染料的平均毫升數(shù)；
V 為樣品提取液的總體積；
V 3 為滴定時(shí)所取的樣品提取液的毫升數(shù)；
M 為 l ml 染料所能氧化抗壞血酸的量（ mg ）（可由操作 2 計(jì)算得到）；
W 為待測樣品的重量（ g ）。


六、注意事項(xiàng)
（ 1 ）用本法測定抗壞血酸含量雖簡便易行，但有下述缺點(diǎn)：第一，本法只能測定還原型抗壞血酸，不能測出具有同樣生理功能的氧化型抗壞血酸和結(jié)合型抗壞血酸。第二，樣品中的色素經(jīng)常干擾對終點(diǎn)的判斷，雖可預(yù)先用自陶土脫色，或加入 2-3 ml 二氯乙烷，以二氯乙烷層變紅為終點(diǎn)，但實(shí)際上仍難兔產(chǎn)生誤差。
（ 2 ）用 2 ％草酸制備提取液，可有效地抑制抗壞血酸氧化酶，以免抗壞血酸變?yōu)檠趸投鵁o法滴定，而 1 ％的草酸無此作用。
（ 3 ）如樣品中有較多亞鐵離子（ Fe 2+ ）時(shí)，也可使染料還原而影響測定，這時(shí)應(yīng)改用 8 ％乙酸代替草酸制備樣品提取液，此時(shí) Fe 2 ＋ 不會很快與染料起作用。
（ 4 ）如樣品漿狀物泡沫過多，可加幾滴辛醇或丁醇消泡。
（ 5 ）市售的 2 ， 6 一二氯酚靛酚質(zhì)量不一，以標(biāo)定 0.4mg 抗壞血酸消耗 2ml 左右的染料為宜，可根據(jù)標(biāo)定結(jié)果調(diào)整染料溶液濃度。
（ 6 ）樣品提取制備和滴定過程中，要避免陽光照射和與銅、鐵器具接觸，以免破壞抗壞血酸。
（ 7 ）滴定過程宜迅速，一般不超過 2min ，樣品滴定消耗染料 1 - 4 ml 為宜，如超出此范圍，應(yīng)增加或減少樣品提取液的用量。
（ 8 ）提取的漿狀物如不易過濾，亦可進(jìn)行離心收集上清液。