實(shí)驗(yàn)——環(huán)境中微生物的檢測(cè)與純化分離

    一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br>
    1．熟悉常用微生物培養(yǎng)基的配制方法。

    2．學(xué)習(xí)并掌握各種無(wú)菌操作技術(shù)，并用此技術(shù)進(jìn)行微生物稀釋分離、劃線分離接種。

    3．用平板劃線法和稀釋法分離微生物。

    4．認(rèn)識(shí)微生物存在的普遍性，體會(huì)無(wú)菌操作的重要性。

    二、實(shí)驗(yàn)原理

    (一)微生物的分離與純化

    土壤是微生物生活的大本營(yíng)，在這里生活的微生物無(wú)論是數(shù)量還是種類都是極其豐富的。因此，土壤是微生物多樣性的重要插所，也是發(fā)掘微生物資源的重要基地，可以從土壤中分離、純化得到許多有價(jià)值的菌株。

    從混雜的微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過(guò)程稱為微生物的分離與純化。常用的是平板分離法。為了獲得某種微生物的純培養(yǎng)，一般是根據(jù)該微生物對(duì)雪養(yǎng)、酸堿度、濃度和氧等條件要求不同，而供給它適宜的培養(yǎng)條件，或加入某些抑制劑抑制其他菌生長(zhǎng)而利于此菌生長(zhǎng)的環(huán)境，從而淘汰其他一些不需要的微生物．再用稀釋涂布平板法或稀釋后平板劃線分離，純化該微生物，直至得到純菌株。

    (二)平板菌落計(jì)數(shù)法

    平板菌落計(jì)數(shù)法是將待測(cè)樣品經(jīng)適當(dāng)稀釋，使其中的微生物充分分散成單個(gè)細(xì)胞，取一定量的稀釋樣液接種到平板上，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)，由每個(gè)單細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖而形成肉眼可見(jiàn)的菌落，即一個(gè)單菌落應(yīng)代表原樣品中的一個(gè)單細(xì)胞．統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)，根據(jù)其稀釋倍數(shù)和取樣接種量即可換算出樣品含菌數(shù)。

    平板菌落計(jì)數(shù)法雖然操作繁瑣，結(jié)果需要培養(yǎng)一段時(shí)間才能取得，而且測(cè)定結(jié)果易受多種因素的影響，但是，由于該計(jì)數(shù)方法的最大優(yōu)點(diǎn)是可以獲得活菌的信息，所以被廣泛用于生物制品檢驗(yàn)(如活菌制劑)，以及食品、飲料和水(包括水源水)等的含菌指數(shù)或污染程度的檢測(cè)。

    三、實(shí)驗(yàn)材料

    土樣10g，未知菌變形桿菌單菌落平板和無(wú)菌水．

    取液器(5m1、l000ml各一支)，培養(yǎng)箱，培養(yǎng)皿(20個(gè))，無(wú)菌有帽試管，三角瓶，無(wú)菌涂棒，接種環(huán)，5ml、1ml無(wú)菌吸頭（移液管），記號(hào)筆，酒精燈，火柴，試管架，牙簽，。

    四，實(shí)驗(yàn)步驟

    (一)培養(yǎng)基的制備(提前準(zhǔn)備)

    按以下步驟制備牛肉膏蛋白胨平板培養(yǎng)基，每組20個(gè)平板。配方參見(jiàn)附錄I．

    1．培養(yǎng)基的制備原則：適當(dāng)?shù)臓I(yíng)養(yǎng)成分；合適的酸堿度，配制后經(jīng)滅菌手續(xù)方可使用．

    2．培養(yǎng)基配制的基本程序：稱量一溶化一測(cè)定及矯正pH一過(guò)濾一分裝—滅菌備用(若配制固體平板培養(yǎng)基，則先滅菌后再傾倒平板備用)。

    3．培養(yǎng)基制備過(guò)程

    (1)稱量：按配方及配制的總量計(jì)算各種成分所需的量分別稱取。

    (2)溶解；將各種成分放入三角瓶(三角瓶體積要大于所裝培養(yǎng)基體積2倍為宜)中，加自來(lái)水(一般配完全培養(yǎng)基用)或蒸餾水至所配培養(yǎng)基的總量，在微波爐中加熱溶解，觀察液體沸騰情況，在液體溢出之前，馬上斷開(kāi)電源，反復(fù)多次，直到完全溶解。

    (3)調(diào)pH值：初溶解好的培養(yǎng)基pH可能不符合要求，需用lmol／L NaOH或lmol／LHCI調(diào)pH至所需范圍，

    (4)過(guò)濾：趁熱用濾紙或多層紗布過(guò)濾，以利于結(jié)果觀察．一般無(wú)特殊要求的情況下，這一步可以省去(本實(shí)驗(yàn)無(wú)需過(guò)濾)。

    (5)分裝；按實(shí)驗(yàn)要求，可將配制的培養(yǎng)基分裝入試管或三角瓶?jī)?nèi)。

    液體分裝：分裝體積不超過(guò)三角瓶體積一半。

    固體分裝：培養(yǎng)基高度為試管的1／3為宜，配斜面培養(yǎng)基時(shí)，一般每試管(直徑為10mm)加5ml左右培養(yǎng)基。分裝三角燒瓶的量以不超過(guò)三角燒瓶容積的一半為宜。

    半固體分裝：培養(yǎng)基高度為試管高度的1／3為宜。

    (6)加塞、包扎和滅菌；分裝后，試管用試管帽，三角瓶用無(wú)菌培養(yǎng)容封口膜（棉塞）封好瓶口，作好標(biāo)記，注明培養(yǎng)基的名稱及配制日期。放人高壓滅菌鍋內(nèi)，加熱沸騰，排空鍋內(nèi)空氣，以蒸汽劇烈噴出為準(zhǔn)，然后升壓到0.1MPa、穩(wěn)壓0.11MPa(121"C)滅菌20min，或全自動(dòng)高壓滅菌鍋中設(shè)定121"C、15~20min滅菌，如果培養(yǎng)基體積較大或含有糖蜜等容易受污染的營(yíng)養(yǎng)復(fù)合物時(shí)，可適當(dāng)延長(zhǎng)滅菌時(shí)間．

    (7)擺斜面和倒平板；制斜面培養(yǎng)基時(shí)，應(yīng)在未凝固前將試管有塞的一頭擱在試管架底層、試管底部擱在桌面，形成斜面，斜度要適當(dāng)，斜面長(zhǎng)度約為試管長(zhǎng)度的1／2，培養(yǎng)基上部離管口5cm以上，凝固后即成斜面．制平板培養(yǎng)基時(shí)，可將培養(yǎng)基冷卻至60～70℃，無(wú)菌操作將培養(yǎng)基倒人已滅菌并干燥的培養(yǎng)皿中，讓其自然流滿整個(gè)子皿底或輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)皿，使其布滿平皿底，蓋上平皿盞，水平靜置，等凝固后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿．每平皿裝量 15~20ml (490mm)，使厚度達(dá)2~3mm。倒平板時(shí)，一般疊放培養(yǎng)皿，以免過(guò)多蒸汽凝結(jié)在皿蓋上。

    (8)無(wú)菌檢查；特制好的培養(yǎng)基置37℃溫箱孵育24h，如無(wú)雜菌生長(zhǎng)即可使用(此步一般省略)．

    (9)較長(zhǎng)時(shí)間不用的斜面或平板可用鋁箔包好，放置4"C冰箱備用．

    （二)周圍環(huán)境中微生物的檢測(cè)

    在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上作如下實(shí)驗(yàn)：

    l，取一個(gè)平板，分成4區(qū)，做好標(biāo)記(下同)．用未洗過(guò)的手指頭以及肥皂洗過(guò)1次、2次、3次的手指頭(不用毛巾擦)分別在4個(gè)區(qū)上涂抹(用力一致)。

    2．取一個(gè)平板，分區(qū),用正在使用的紙巾、硬幣分別在不同的區(qū)上拖動(dòng)2～3次。

    3．往培養(yǎng)基上放置一根頭發(fā)，并用無(wú)菌涂布器壓緊。

    4．取一個(gè)子板，將稍稍打開(kāi)的嘴唇在培養(yǎng)基上壓一下，檢查嘴唇上的細(xì)菌。

    5．取一個(gè)平板，分區(qū)，用無(wú)菌接種環(huán)分別沾一環(huán)自來(lái)水、河水以及礦泉水在平板不同區(qū)上畫線。

    6．用無(wú)菌牙簽取一點(diǎn)牙垢在一個(gè)平板培養(yǎng)基上畫線。

    7．取兩個(gè)乎板，一個(gè)打開(kāi)皿蓋，置實(shí)驗(yàn)臺(tái)上(空氣中)l0min，另一個(gè)按無(wú)菌操作要求在酒精燈火焰邊打開(kāi)皿蓋lmin。

    8．取一個(gè)平板，打開(kāi)皿蓋，對(duì)著培養(yǎng)基咳嗽。

    9．另兩個(gè)平扳可根據(jù)自己的興趣，自由用來(lái)檢測(cè)。

    以上平板用報(bào)紙包好倒置于37℃培養(yǎng)箱里培養(yǎng)24h觀察結(jié)果。

    任何一個(gè)實(shí)驗(yàn)，在動(dòng)手操作前均需先用記號(hào)筆在培養(yǎng)皿底做好標(biāo)記。標(biāo)記包括培養(yǎng)物名稱、班級(jí)、姓名、日期．標(biāo)記應(yīng)明了、占地少，并做在乎皿底邊緣，不要做在中間，以免影響結(jié)果觀察。

    本組的平板要統(tǒng)一用報(bào)紙包好，在外面寫上組號(hào)，以免同學(xué)拿亂，找不到自己的平板。

    (三)從土壤中分離微生物

    1． 采土樣：選擇較肥沃韻土壤，鏟去表層土，挖5~20cm深度的或特殊要求的土壤數(shù)十克，裝入已滅菌的牛皮紙袋，封好袋口，做好編號(hào)記錄，帶回實(shí)驗(yàn)室供分離用。

    2． 制備土壤稀釋液，稱取土樣1.0g，放人盛99ml無(wú)菌水井帶有玻璃珠的三角瓶中，置搖床振蕩5min使土壤均勻分散成為土壤懸液(10-2)。用1ml的無(wú)菌吸頭從中吸駐0.5ml土壤懸液，注人事先分裝有4.5ml無(wú)菌水的試管中，吹吸3次，振蕩均勻(10-3)。換一只新的無(wú)菌吸頭，用同樣方法，分別配置成稀釋度為10-4、10-5、10-6的土壤溶液。

    3． 涂布：用一只新的無(wú)菌吸頭，分別由各濃度土壤稀釋液中各吸取100μ1，對(duì)號(hào)較均勻地放入已寫好稀釋度的牛肉蛋白胨培養(yǎng)基平板上，用無(wú)菌玻璃涂棒涂勻，一定要多涂幾遍，從概率角度來(lái)說(shuō)，涂到細(xì)菌均勻分布為止，此步是實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵。每個(gè)濃度做3個(gè)平板。

    4． 培養(yǎng)：將牛肉蛋白胨培養(yǎng)基平板倒置于37℃溫箱中培養(yǎng)24h，統(tǒng)計(jì)所長(zhǎng)出的菌落數(shù)．

    5． 菌落計(jì)數(shù)；培養(yǎng)24h后，取出培養(yǎng)乎板，算出同一稀釋度三個(gè)平扳上的菌落平均數(shù)，換算出土樣中的菌含量。

    有較大片菌苔生長(zhǎng)時(shí)，棄用，以無(wú)大片菌苔生長(zhǎng)的培養(yǎng)皿計(jì)數(shù)；如成片菌苔大小不到培養(yǎng)皿的一半，其余一半分布均勻，將此一半計(jì)數(shù)×2。

    選擇平均菌落數(shù)在30~300間的平板。只有一個(gè)濃度符合此范圍時(shí)，以該平均菌落數(shù)乘稀釋倍數(shù)即為該樣品中菌總數(shù)；有兩個(gè)濃度平板的菌落數(shù)在30-300時(shí)，按兩者菌落總數(shù)比值決定：比值小于2，取平均，比值大于2，取較少的菌落總數(shù)：

    所有菌落數(shù)均大于300，取稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘稀釋倍數(shù)；

    所有菌落數(shù)均小于30，取稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘稀釋倍數(shù)．

    所有菌落數(shù)均不在30~300間，以最接近30或300的平均菌落乘以稀釋倍數(shù)．