半定量RT-PCR的實驗原理和方法步驟

    RT-PCR將以RNA為模板的cDNA合成同PCR結(jié)合在一起，提供了一種分析基因表達的快速靈敏的方法。RT-PCR用于對表達信息進行檢測或定量。另外，這項技術(shù)還可以用來檢測基因表達差異或不必構(gòu)建cDNA文庫克隆cDNA。RT-PCR比其他包括Northern印跡、RNase保護分析、原位雜交及S1核酸酶分析在內(nèi)的RNA分析技術(shù)，更靈敏，更易于操作。

    RT-PCR的模板可以為總RNA或poly(A)+選擇性RNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)可以使用逆轉(zhuǎn)錄酶，以隨機引物、oligo(dT)或基因特異性的引物（GSP）起始。RT-PCR可以一步法或兩步法的形式進行。在兩步法RT-PCR中，每一步都在最佳條件下進行。cDNA的合成首先在逆轉(zhuǎn)錄緩沖液中進行，然后取出1/10的反應(yīng)產(chǎn)物進行PCR。在一步法RT-PCR中，逆轉(zhuǎn)錄和PCR在同時為逆轉(zhuǎn)錄和PCR優(yōu)化的條件下，在一只管中順次進行。

    實驗步驟：
    Trizol法RNA提取步驟
    1、提取總RNA
    2、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
    3、PCR反應(yīng)
    以下實驗步驟僅供參考：
    1 樣品RNA的抽提
    ①取凍存已裂解的細胞，室溫放置5分鐘使其完全溶解。
    ②兩相分離
    每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的氯仿，蓋緊管蓋。手動劇烈振蕩管體15秒后，15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12000rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚氯仿相，中間層以及無色水相上層。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時加入的TRIZOL試劑的60%。
    ③RNA沉淀
    將水相上層轉(zhuǎn)移到一干凈無RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA，混勻后15到30℃孵育10分鐘后，于4℃下12000rpm
    離心10分鐘。此時離心前不可見的RNA沉淀將在管底部和側(cè)壁上形成膠狀沉淀塊。
    ④RNA清洗
    移去上清液，每1mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混勻后，4℃下7000rpm離心5分鐘。
    ⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。
    ⑥溶解RNA沉淀
    溶解RNA時，先加入無RNA酶的水40μl用槍反復(fù)吹打幾次，使其完全溶解，獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。


    2 RNA質(zhì)量檢測
    1）紫外吸收法測定
    先用稀釋用的TE溶液將分光光度計調(diào)零。然后取少量RNA溶液用TE稀釋（1:100）后，讀取其在分光光度計260nm和280nm處的吸收值，測定RNA溶液
    濃度和純度。
    ① 濃度測定
    A260下讀值為1表示40 μg RNA/ml。樣品RNA濃度(μg/ml)計算公式為：A260 ×稀釋倍數(shù)× 40
    μg/ml。具體計算如下：
    RNA溶于40 μl DEPC水中，取5ul，1:100稀釋至495μl的TE中，測得A260=0.21
    RNA 濃度=0.21 ×100 ×40 μg/ml=840 μg/ml 或 0.84 μg/μl
    取5ul用來測量以后，剩余樣品RNA為35 μl，剩余RNA總量為：
    35 μl × 0.84 μg/μl=29.4 μg
    ②純度檢測
    RNA溶液的A260/A280的比值即為RNA純度，比值范圍1.8到2.1。
    2）變性瓊脂糖凝膠電泳測定
    ①制膠
    1g瓊脂糖溶于72ml水中，冷卻至60℃，10 ml的10× MOPS電泳緩沖液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3
    M)。
    10×MOPS電泳緩沖液
    濃度    成分
    0.4M    MOPS，pH 7.0
    0.1M    乙酸鈉
    0.01M    EDTA
    灌制凝膠板，預(yù)留加樣孔至少可以加入25
    μl溶液。膠凝后取下梳子，將凝膠板放入電泳槽內(nèi)，加足量的1×MOPS電泳緩沖液至覆蓋膠面幾個毫米。
    ②準備RNA樣品
    取3μgRNA，加3倍體積的甲醛上樣染液，加EB于甲醛上樣染液中至終濃度為10μg/ml。加熱至70℃孵育15分鐘使樣品變性。
    ③電泳
    上樣前凝膠須預(yù)電泳5min，隨后將樣品加入上樣孔。5–6V/cm電壓下2h，電泳至溴酚蘭指示劑進膠至少2–3cm。
    ④紫外透射光下觀察并拍照
    28S和18S核糖體RNA的帶非常亮而濃（其大小決定于用于抽提RNA的物種類型），上面一條帶的密度大約是下面一條帶的2倍。還有可能觀察到一個更小稍微擴散的帶，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖體RNA）組成。在18S和28S核糖體帶之間可以看到一片彌散的EB染色物質(zhì)，可能是由mRNA和其它異型RNA組成。RNA制備過程中如果出現(xiàn)DNA污染，將會在28S核糖體RNA帶的上面出現(xiàn)，即更高分子量的彌散遷移物質(zhì)或者帶，RNA的降解表現(xiàn)為核糖體RNA帶的彌散。用數(shù)碼照相機拍下電泳結(jié)果。

    3樣品cDNA合成
    ①反應(yīng)體系
    序號    反應(yīng)物    劑量
    1    逆轉(zhuǎn)錄buffer    2μl
    2    上游引物    0.2μl
    3    下游引物    0.2μl
    4    dNTP    0.1μl
    5    逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV    0.5μl
    6    DEPC水    5μl
    7    RNA模版    2μl
    8    總體積    10μl
    輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。
    ②混合液在加入逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV
    之前先70℃干浴3分鐘，取出后立即冰水浴至管內(nèi)外溫度一致，然后加逆轉(zhuǎn)錄酶0.5μl，37℃水浴60分鐘。
    ③取出后立即95℃干浴3分鐘，得到逆轉(zhuǎn)錄終溶液即為cDNA溶液，保存于-80℃待用。


    4梯度稀釋的標準品及待測樣品的管家基因（β-actin）實時定量PCR
    ①β-actin陽性模板的標準梯度制備
    陽性模板的濃度為1011，反應(yīng)前取3μl按10倍稀釋（加水27μl并充分混勻）為1010，依次稀釋至109、108、107、106、105、104，以備用。
    ②反應(yīng)體系如下：
    標準品反應(yīng)體系
    序號    反應(yīng)物    劑量
    1     SYBR Green 1 染料    10μl
    2    陽性模板上游引物F    0.5μl
    3    陽性模板下游引物R    0.5μl
    4    dNTP    0.5μl
    5    Taq酶    1μl
    6    陽性模板DNA    5μl
    7    ddH2O    32.5μl
    8    總體積    50μl
    輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。
    管家基因反應(yīng)體系：
    序號    反應(yīng)物    劑量
  1    SYBR Green 1 染料    10μl
    2    內(nèi)參照上游引物F    0.5μl
    3    內(nèi)參照下游引物R    0.5μl
    4    dNTP    0.5μl
    5    Taq酶    1μl
    6    待測樣品cDNA    5μl
    7    ddH2O    32.5μl
    8    總體積    50μl
    輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。
    ③制備好的陽性標準品和檢測樣本同時上機，反應(yīng)條件為：93℃ 2分鐘，然后93℃ 1分鐘，55℃ 2分鐘，共40個循環(huán)。


    5 制備用于繪制梯度稀釋標準曲線的DNA模板
    ①針對每一需要測量的基因，選擇一確定表達該基因的cDNA模板進行PCR反應(yīng)。
    反應(yīng)體系：
    序號    反應(yīng)物    劑量
    1    10×PCR緩沖液    2.5 ul
    2    MgCl2溶液    1.5 ul
    3    上游引物F    0.5ul
    4    下游引物R    0.5ul
    5    dNTP混合液    3ul
    6    Taq聚合酶    1ul
    7    cDNA    1ul
    8    加水至總體積為    25ul
    輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。
    35個PCR循環(huán)（94℃1分鐘；55℃1分鐘；72℃1分鐘）； 72oC延伸5分鐘。
    ②PCR產(chǎn)物與 DNA Ladder在2％瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，檢測PCR產(chǎn)物是否為單一特異性擴增條帶。
    ③將PCR產(chǎn)物進行10倍梯度稀釋: 將PCR產(chǎn)物進行10倍梯度稀釋:
    設(shè)定PCR產(chǎn)物濃度為1×1010，依次稀釋至109、108、107、106、105、104幾個濃度梯度。


    6 待測樣品的待測基因?qū)崟r定量PCR
    ①所有cDNA樣品分別配置實時定量 PCR反應(yīng)體系。
    體系配置如下：序號    反應(yīng)物    劑量
    1    SYBR Green 1 染料  10 ul
    2    上游引物    1ul
    3    下游引物    1ul
    4    dNTP   1ul
    5    Taq聚合酶    2ul
    6    待測樣品cDNA    5ul
    7    ddH2O   30ul
    8    總體積    50ul
    輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。
    ②將配制好的PCR反應(yīng)溶液置于Realtime PCR儀上進行PCR擴增反應(yīng)。反應(yīng)條件為：93℃2分鐘預(yù)變性，然后按93℃
    1分鐘，55℃1分鐘，72℃1分鐘，共40做個循環(huán)，最后72℃7分鐘延伸。7 實時定量PCR使用引物列表
    引物設(shè)計軟件：Primer Premier
    5.0，并遵循以下原則：引物與模板的序列緊密互補；引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)；引物不在模板的非目的位點引發(fā)DNA聚合反應(yīng)(即錯配)。