熒光定量PCR原理應(yīng)用及流程介紹 @遠慕生物

熒光定量PCR簡介

熒光定量PCR檢測技術(shù)誕生至今已10多年的時間，而其應(yīng)用一直都沒廣泛展開，究其原因，無外乎受制于相關(guān)儀器、試劑和技術(shù)的發(fā)展。近期，尤其是08年以來，儀器和試劑是遍地開花，這也使科研人員均躍躍欲試，都想借此技術(shù)使自己的研究能突飛猛進，發(fā)展勢頭通過查找每年所發(fā)表的文章數(shù)可一目了然。據(jù)有關(guān)統(tǒng)計，在 Medline 數(shù)據(jù)庫中，用“Taqman” 或 ”real time PCR” 作為關(guān)鍵詞檢索，1996 年是19 篇，1999 年157 篇，到2003 年就高達2984 篇，2009年會是多少呢？我們不得而知。但其迅猛的發(fā)展勢頭卻是不可更改的，本公司真誠希望能和眾多研究人員共同努力，抓住這一大好時機，為科研事業(yè)的發(fā)展貢獻自身的力量?；谶@一目標，本公司長期以來對熒光定量PCR，無論是技術(shù)還是多年來的產(chǎn)品，均進行了深入地研究，并及時推出更加優(yōu)異的熒光定量 PCR技術(shù)服務(wù)。

熒光定量PCR原理

熒光定量PCR最早稱TaqMan PCR，后來也叫Real-Time PCR，是美國PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標記探針或相應(yīng)的熒光染料來實現(xiàn)其定量功能的。其原理：隨著PCR反應(yīng)的進行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計，熒光信號強度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光強度信號，這樣我們就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴增曲線圖。

一般而言，熒光擴增曲線可以分成三個階段：熒光背景信號階段，熒光信號指數(shù)擴增階段和平臺期。在熒光背景信號階段，擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺期，擴增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加，PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，根據(jù)最終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號指數(shù)擴增階段， PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，我們可以選擇在這個階段進行定量分析。為了定量和比較的方便，在實時熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個非常重要的概念：熒光閾值和 CT值。



熒光域值（threshold）

是在熒光擴增曲線上人為設(shè)定的一個值，它可以設(shè)定在熒光信號指數(shù)擴增階段任意位置上，但一般熒光域值的缺省設(shè)置是PCR反應(yīng)前3-15個循環(huán)熒光信號標準偏差的10倍，即：threshold。

Ct 值：是指每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。

Ct值與起始模板的關(guān)系：

研究表明，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標代表Ct值如下圖所示。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。

熒光定量檢測

熒光定量檢測根據(jù)所使用的標記物不同可分為熒光探針和熒光染料。熒光探針又包括Beacon技術(shù)（分子信標技術(shù)，以美國人Tagyi為代表）、 TaqMan探針（以美國ABI公司為代表）和FRET技術(shù)（以羅氏公司為代表）等；熒光染料包括飽和熒光染料和非飽和熒光染料，非飽和熒光染料的典型代表就是現(xiàn)在最常用的SYBR GreenⅠ；飽和熒光染料有EvaGreen、LC Green等。

嵌合熒光染料法（SYBR GreenⅠ）

SYBR Green I是熒光定量PCR最常用的DNA結(jié)合染料，與雙鏈DNA非特異性結(jié)合。在游離狀態(tài)下，SYBR Green I發(fā)出微弱的熒光，但一旦與雙鏈DNA結(jié)合，其熒光增加1000倍。所以，一個反應(yīng)發(fā)出的全部熒光信號與出線的雙鏈DNA量呈比列，且會隨擴增產(chǎn)物的增加而增加。

SYBR Green I熒光染料與DNA雙鏈的結(jié)合

雙鏈DNA結(jié)合染料的優(yōu)點：實驗設(shè)計簡單，僅需要2個引物，不需要設(shè)計探針，無需設(shè)計多個探針即可以快速檢驗多個基因，且能夠進行熔點曲線分析，檢驗擴增反應(yīng)的特異性，低的初始成本，通用性好，因此國內(nèi)外在科研中使用比較普遍。

熒光探針法（Taqman 技術(shù)）：PCR擴增時，加入一對引物的同時再加入一個特異性的熒光探針。該探針為一直線型的寡核苷酸，兩端分別標記一個熒光報告基團和一個熒光淬滅基團，探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收，PCR 儀檢測不到熒光信號； PCR擴增時（在延伸階段），Taq 酶的 5' － 3' 切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條 DNA 鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與 PCR 產(chǎn)物形成完全同步，這也是定量的基礎(chǔ)所在。其過程如下圖所示

熒光定量PCR的應(yīng)用

分子生物學(xué)研究

1 核酸定量分析。 對傳染性疾病進行定量定性分析，病原微生物或病毒含量的檢測 , 比如近期流行的甲型H1N1流感， 轉(zhuǎn)基因動植物基因拷貝數(shù)的檢測，RNAi 基因失活率的檢測等。

2 基因表達差異分析。 比較經(jīng)過不同處理樣本之間特定基因的表達差異 ( 如藥物處理、物理處理、化學(xué)處理等 ) ，特定基因在不同時相的表達差異以及cDNA芯片或差顯結(jié)果的確證

3 SNP 檢測。檢測單核苷酸多態(tài)性對于研究個體對不同疾病的易感性或者個體對特定藥物的不同反應(yīng)有著重要的意義，因分子信標結(jié)構(gòu)的巧妙性，一旦SNP 的序列信息是已知的，采用這種技術(shù)進行高通量的 SNP 檢測將會變得簡單而準確。

4 甲基化檢測。甲基化同人類的許多疾病有關(guān)，特別是癌癥， Laird 報道了一種稱作 Methylight的技術(shù)，在擴增之前先處理 DNA ，使得未甲基化的胞嘧啶變成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不受影響，用特異性的引物和 Taqman探針來區(qū)分甲基化和非甲基化的 DNA ，這種方法不僅方便而且靈敏度更高。

醫(yī)學(xué)研究

5 產(chǎn)前診斷：人們對遺傳性物質(zhì)改變引起的遺傳性疾病還無法治療，到目前為止，還只能只能通過產(chǎn)前監(jiān)測，減少病嬰出生，以防止各類遺傳性疾病的發(fā)生，如為減少X連鎖遺傳病患兒的出生，從孕婦的外周血中分離胎兒DNA，用實時熒光定量PCR檢測其Y性別決定區(qū)基因是一種無創(chuàng)傷性的方法，易為孕婦所接受。

6 病原體檢測：采用熒光定量PCR檢測技術(shù)可以對淋球菌、沙眼衣原體、解脲支原體、人類乳頭瘤病毒、單純皰疹病毒、人類免疫缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒、結(jié)核分枝桿菌、EB病毒和巨細胞病毒等病原體進行定量測定。與傳統(tǒng)的檢測方法相比具有靈敏度高、取樣少、快速簡便等優(yōu)點。

7 藥物療效考核：對乙型肝炎病毒 (HBV)、丙型肝炎病毒 (HCV) 定量分析顯示：病毒量與某些藥物的療效關(guān)系。HCV高水平表達，干擾素治療作用不敏感，而HCV低滴度，干擾素作用敏感；在拉米夫定治療過程中，HBV- DNA的血清含量曾有下降，隨后若再度上升或超出以前水平，則提示病毒發(fā)生變異。

8 腫瘤基因檢測：盡管腫瘤發(fā)病的機理尚未清楚，但相關(guān)基因發(fā)生突變是致癌性轉(zhuǎn)變的根本原因已被廣泛接受。癌基因的表達增加和突變，在許多腫瘤早期就可以出現(xiàn)。實時熒光定量 PCR不但能有效地檢測到基因的突變，而且可以準確檢測癌基因的表達量。目前用此方法進行過端粒酶hTERT基因、慢性粒細胞性白血病WT1基因、腫瘤 ER基因、前列腺癌PSM基因、腫瘤相關(guān)的病毒基因等多種基因的表達檢測。