如何選擇正確內(nèi)參抗體，這些你需了解！

內(nèi)參抗體可用于評價蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western Blot)的效率，比較凝膠中每孔的蛋白上樣量。此類對照可幫助確定樣品間表達(dá)水平的差異，以判斷是由細(xì)胞裂解物的實際蛋白水平導(dǎo)致，還是由上樣量的差異導(dǎo)致。

內(nèi)參抗體在目標(biāo)蛋白的免疫熒光研究中，也可以作為共染的陽性對照。內(nèi)參抗體分為未標(biāo)記型和標(biāo)記型，標(biāo)記物包括生物素、HRP、FITC、PE、Cy染料和Alexa Fluor染料。
內(nèi)參抗體種類很多，比如β-actin、β-tubunlin、GAPDH、Vinculin、Lamin B、PCNA等，其選擇常使我們困惑。本文將簡單介紹選擇內(nèi)參抗體應(yīng)遵循的五項原則：

一、樣本種屬來源：

首先要考慮實驗樣本來源于什么物種。

1. 哺乳動物的組織或者細(xì)胞樣本，通常選擇β-actin、β-tubulin、GAPDH、Lamin B、Histone H3、Na,Katpase等。

2. 植物來源實驗樣本，則可以選擇plant actin、Rubisco等。

3. 其他來源樣本研究較少，所以就應(yīng)該參照文獻(xiàn)報導(dǎo)，選擇合適的蛋白作為內(nèi)參。

二、分子量大?。?br>
選擇內(nèi)參抗體時，應(yīng)該考慮目的蛋白分子量的大小，一般保證目的蛋白與內(nèi)參蛋白分子量相差5KD以上。例如，目的蛋白分子量為40KD，此時不適宜選擇β-actin、與GAPDH作為內(nèi)參，可以考慮選擇α-Tubulin或者β-tubulin作為內(nèi)參。

三、表達(dá)水平：

選擇的內(nèi)參蛋白需要在待測樣本中是高表達(dá)的。常用的內(nèi)參蛋白是由管家基因高表達(dá)的，是細(xì)胞發(fā)育和維持細(xì)胞活力所必須的。例如，細(xì)胞核的內(nèi)參蛋白 PCNA，在 DNA S 期表達(dá)，因此對于非增殖細(xì)胞不推薦使用。

四、表達(dá)因素：

選擇蛋白表達(dá)不受實驗變量影響的內(nèi)參。

●在做多組織多細(xì)胞樣本對比表達(dá)量時，zui好選用 GAPDH作為內(nèi)參，因為GAPDH是代謝類蛋白，在活組織中表達(dá)比較恒定。而β-Actin和β-Tubulin是結(jié)構(gòu)蛋白，不同組織的細(xì)胞結(jié)構(gòu)會有差異性；

●而在某些細(xì)胞中，由于組織缺氧、糖尿病等因素會導(dǎo)致GAPDH的表達(dá)增高，不適合做內(nèi)參；

●涉及細(xì)胞增殖的相關(guān)試驗中，c-Jun由于自身表達(dá)變化不適合做內(nèi)參；

●凋亡實驗時，TBP、Lamin等也不適合作為內(nèi)參；

●做誘導(dǎo)后樣本或檢測磷酸化等修飾性抗體時，應(yīng)選擇結(jié)構(gòu)蛋白作為內(nèi)參，如β-Actin 和β-Tubulin；

●做各種分泌液樣本的時候，如血漿、乳汁、組織液等，由于沒有完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，只能選擇一些分泌蛋白作為內(nèi)參。