如何從小白成為扎細(xì)胞小能手

看到了很多做分子細(xì)胞的小伙伴分享了經(jīng)驗心得，今天也想來試著分享一下神經(jīng)電生理（在此僅指急性腦切片膜片鉗技術(shù)）方面的一些小經(jīng)驗。

 

 

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實踐篇——知其然

 

扎細(xì)胞的基本操作步驟：

 

1）配好 ACSF 充氧（tip：氧要飽和！根據(jù)實驗對象、目的、課題設(shè)計等各種主客觀情況選用合適的方法技術(shù)）

 

2）打開各種儀器?；揪褪茄h(huán)灌流系統(tǒng)（簡單地說就是蠕動泵，使腦片記錄槽中氧飽和的人工腦脊液不斷更換，可防止腦片細(xì)菌滋生）、顯微觀察系統(tǒng)（tip：Olympus、Zeiss 等guan網(wǎng)可以了解很多相關(guān)知識）、記錄采集系統(tǒng)三大模塊。（tip：在記錄槽充滿溶液的時候再打開加熱器，干燒容易把電阻燒壞；先開硬件，再開軟件，否則會報錯！）

 

3）拉制電極。一般記錄細(xì)胞的電極阻值為 3～5 MΩ。太細(xì)，破膜后容易重新被阻塞，影響記錄狀態(tài)。

 

4）從 -20 ℃ 取出人工細(xì)胞內(nèi)液（冰上保存，因為內(nèi)液里有 ATP，溫度太高會分解），DIY 針管注射器，燒軟稍涼一會兒再拉伸成適合粗細(xì)長度。

 

圖 1

 

5）用自制 pipette（玻璃吸管）從自制 chamber（孵育杯）中取出腦片，此時應(yīng)保證記錄灌流通路的溶液環(huán)境不會缺少氧氣。

 

6）用鉑金片背面壓住腦片（tip：保證盡可能固定，否則腦片震動使記錄不穩(wěn)定），調(diào)整 DIC 至能清晰看到立體飽滿的細(xì)胞形態(tài)（此處插播「何為 DIC」： 中文名——微分紅外干涉相差成像，就是可以用來觀看細(xì)胞形態(tài)的黑白小電視）主要調(diào)節(jié)聚光鏡光斑，使光斑集中點落在腦片上。有時一直白茫茫一片，可能是光源太亮而過度曝光，或者是鏡頭與液面之間有氣泡。此時只需調(diào)小亮度或是抬起鏡頭重新入水即可。

 

7）用之前 DIY 拉伸好的注射器向微電極中灌注內(nèi)液，內(nèi)液應(yīng)沒過電極中的銀絲，才能與記錄液中的地線連通整個電路，給電極合適正壓。（tip：氣壓太大對腦組織擾動太大，太小腦組織不能被吹開，會阻礙電極接近細(xì)胞。）

 

8）用顯微鏡找好目標(biāo)細(xì)胞，然后找電極。（圖 2—6）

 

圖 2. DIC 圖中的電極

 

圖 3.DIC 圖中的腦片表面

 

圖 4. DIC 圖中帶著正壓的電極接近細(xì)胞

 

圖 5. DIC 圖中的電極正壓將細(xì)胞膜表面吹出小坑

 

圖 6. DIC 圖中釋放正壓的電極與細(xì)胞膜形成高阻封接

 

9）電極入水后點擊放大器面板（附圖 7）的 Offset 及測試電壓方波 Seal test。

 

 

10）將微操作器行進(jìn)速度降低至 3 檔，電極階梯式接近細(xì)胞（tip：一定要看到組織適當(dāng)被吹開，細(xì)胞形態(tài)變清晰的感覺），從斜正上方壓細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)即將出現(xiàn)（tip：注意時機，迅速把握）氣壓吹出的坑時立即釋放正壓，當(dāng)示波器波形由剛開始的方波形變成一條直線（即電極與細(xì)胞膜之間形成 GΩ高阻封接）時，快速點擊 Holding。

 

11）然后補償快慢膜電容，用負(fù)壓破膜，至此連通了電極內(nèi)液與細(xì)胞內(nèi)液。（tip：破膜過程可以使用 zap 電擊輔助破膜。電容充放電越快，說明破膜情況越好。）

 

12）根據(jù)實驗?zāi)康慕o細(xì)胞不同電刺激，記錄電信號。（圖 8）

 

 

13）對于腦片出現(xiàn)細(xì)菌的小問題，在不做實驗時可用 3% 過氧化氫灌流沖洗整個水路（循環(huán)灌流通路）再用雙蒸餾水沖洗，以防過氧化氫影響細(xì)胞狀態(tài)。

 

 

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理論——知其所以然

 

1）多位前輩代代相傳的入門寶典：

《電生理學(xué)方法與儀器入門》，（荷）布雷特奇德著，機械工業(yè)出版社（一本深藍(lán)色小書）；《實用膜片鉗技術(shù)》，劉振偉著，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社（是經(jīng)典，必備）；

 

2）電生理記錄儀器認(rèn)知要點：

 

信號放大器——通過二極管對微小的模擬信號進(jìn)行放大數(shù)模轉(zhuǎn)換器——只認(rèn)識電壓指令，是放大器的模擬信號與電腦的數(shù)字信號之間進(jìn)行溝通的橋梁信號采集記錄軟件（Spike2，signal 或 pClamp……）

 

 

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其他碎碎念

 

 

如何找到目標(biāo)腦區(qū)？

個人覺得一個不熟悉的腦區(qū)，首先通過查圖譜進(jìn)行了解。靠譜的圖譜可以是 Allen brain institute（圖 9），包括各腦區(qū)的基本輪廓（立體、水平切面、矢狀切面、冠狀切面）、基因表達(dá)、細(xì)胞投射等情況。也可以是相應(yīng)的大鼠、小鼠腦圖譜外文原版書籍。