如何進(jìn)行細(xì)胞系鑒定 你看懂了么？

很多生物醫(yī)藥的研究都采用培養(yǎng)細(xì)胞來進(jìn)行, 這些細(xì)胞可能是從細(xì)胞庫(kù) (如美國(guó) ATCC，American Type Culture Collection) 得來，也可能是受贈(zèng)于其它研究人員，尤其在中國(guó)，目前細(xì)胞的傳播太復(fù)雜，無序，很多都不是通過正規(guī)途徑獲得，如友情贈(zèng)送等。
 

據(jù)統(tǒng)計(jì)，約有 30% 細(xì)胞系被交叉污染或錯(cuò)誤辨識(shí)，因使用了交叉污染或錯(cuò)誤辨識(shí)的細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致研究結(jié)論錯(cuò)誤、結(jié)果不可重復(fù)、臨床細(xì)胞治療失敗等。不僅浪費(fèi)大量時(shí)間、精力和金錢，還可能造成不可挽回的災(zāi)難性后果。為此，很多細(xì)胞庫(kù)現(xiàn)在都要對(duì)提交來的細(xì)胞系進(jìn)行鑒定，并對(duì)細(xì)胞系之間的交叉污染進(jìn)行監(jiān)測(cè)。

細(xì)胞系鑒定的必要性

1、各種雜志多次發(fā)出呼吁，要求研究者對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定，NIH 等機(jī)構(gòu)也將細(xì)胞系鑒定作為基金申請(qǐng)的前提條件。

2011 年，美國(guó)專門頒布了細(xì)胞 STR 鑒定國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)；

2014 年 12 月、2015 年 2 月 Science 雜志分別發(fā)表文章專題闡述細(xì)胞交叉污染和錯(cuò)誤辨識(shí)的嚴(yán)重性；

2015 年 4 月 Nature 通知：Nature 旗下所有雜志將要求作者鑒定論文中所用細(xì)胞系；

2015 年 6 月即有報(bào)道稱一科學(xué)家因用錯(cuò)細(xì)胞系，撤銷 Nature 論文。
 

目前要求提供細(xì)胞鑒定數(shù)據(jù)的期刊有：Nature、BioTechniques、Cancer Research、Cancer Discovery、Clinical Cancer Research、Molecular Cancer Research、Cancer Prevention Research、International Journal of Cancer、Molecular Cancer Therapeutics、Cell Biochemistry and Biophysics、Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention、In Vitro Cellular & Developmental Biology – Animal 等。
 

2、ATCC 和 FDA 要求對(duì)用于制藥領(lǐng)域的實(shí)驗(yàn)中所使用的材料 — 諸如細(xì)胞系 — 應(yīng)該進(jìn)行「身份鑒定」和純度測(cè)試。

此外，F(xiàn)DA 建議研究人員在培養(yǎng)細(xì)胞的較早階段（細(xì)胞培養(yǎng)周）來鑒定細(xì)胞系的身份。細(xì)胞在被凍存前應(yīng)再一次進(jìn)行鑒定; 對(duì)于活躍生長(zhǎng)的細(xì)胞, 每?jī)蓚€(gè)月應(yīng)鑒定一次；文獻(xiàn)發(fā)表前也應(yīng)對(duì)細(xì)胞系身份進(jìn)行鑒定。如果一個(gè)實(shí)驗(yàn)室使用不止一種細(xì)胞系, 則應(yīng)在實(shí)驗(yàn)開始時(shí), 就要對(duì)所有的細(xì)胞系進(jìn)行鑒定, 以便排除交叉污染。
 

3、2015 新版藥典中，規(guī)定新建細(xì)胞系/株、細(xì)胞庫(kù)（MCB、WCB）和生產(chǎn)終末細(xì)胞均應(yīng)進(jìn)行鑒別試驗(yàn)，以確認(rèn)為本細(xì)胞，且無其他細(xì)胞的交叉污染。

細(xì)胞鑒別試驗(yàn)方法有多重，包括細(xì)胞形態(tài)、生物化學(xué)法（如同工酶試驗(yàn)）、免疫學(xué)檢測(cè)（如同工酶試驗(yàn)）、免疫學(xué)檢測(cè)（如組織相容性抗原、種特異性免疫血清）、細(xì)胞遺傳學(xué)檢測(cè)（如染色體核型、標(biāo)記染色體檢測(cè)）、遺傳標(biāo)志檢測(cè)（如 DNA 指紋圖譜，包括短串聯(lián)重復(fù)序列（STR）、限制片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP-PCR）和內(nèi)含子多態(tài)性（EPIC-PCR）法等）以及其他方法（如雜交法、PCR 法、報(bào)告基因法等）。應(yīng)至少選擇上述一種或幾種方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行種屬和細(xì)胞株間及專屬特性的鑒別。（——《生物制品生產(chǎn)檢定用動(dòng)物細(xì)胞基質(zhì)制備及鑒定規(guī)程》）

何時(shí)需要進(jìn)行細(xì)胞系鑒定？

● 發(fā)表相關(guān)文章或申請(qǐng)課題經(jīng)費(fèi)
● 應(yīng)用細(xì)胞系作為生物藥研究的實(shí)驗(yàn)材料
● 使用細(xì)胞進(jìn)行臨床治療（試驗(yàn)）
● 準(zhǔn)備凍存保種或已凍存多年的細(xì)胞
● 一個(gè)涉及到細(xì)胞試驗(yàn)項(xiàng)目開始/結(jié)束
● 新得到的細(xì)胞或?qū)嶒?yàn)室傳 5 代以上的細(xì)胞
● 細(xì)胞系表現(xiàn)不穩(wěn)定或結(jié)果與預(yù)期差別較大

細(xì)胞系鑒定方法
 

細(xì)胞培養(yǎng)中可以使用許多方法對(duì)交叉污染進(jìn)行鑒定，如同功酶分析、染色體組分型、人淋巴細(xì)胞抗原 (HLA) 分型和擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性 (AFLP) 的特征分析、STR 分析等。
 

近年來，大量研究表明 STR 基因分型方法是進(jìn)行細(xì)胞交叉污染和性質(zhì)鑒定的有效和準(zhǔn)確的方法之一，STR 基因分型已經(jīng)被 ATCC 等細(xì)胞庫(kù)組織作為金標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用于細(xì)胞系鑒定 (ANSI/ATCC ASN-0002-2011)。美國(guó)的 ATCC 細(xì)胞庫(kù)、德國(guó)的 DSMZ 細(xì)胞庫(kù)以及日本的 JCRB 細(xì)胞庫(kù)等為 STR 分型提供了各細(xì)胞株的數(shù)據(jù)供比對(duì)。
 

STR 基因位點(diǎn)由長(zhǎng)度為 3~7 個(gè)堿基對(duì)的短串聯(lián)重復(fù)序列組成，這些重復(fù)序列廣泛存在于人類基因組中，可作為高度多態(tài)性標(biāo)記，被稱為細(xì)胞的 DNA 指紋，其可通過一定的計(jì)算方法，即可根據(jù)所得的 STR 分型結(jié)果與專業(yè)的細(xì)胞 STR 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)從而推算出樣品所屬的細(xì)胞系或可能的交叉污染的細(xì)胞系名稱。

STR 鑒定的試驗(yàn)流程
 

細(xì)胞 DNA 提取——多色熒光體系復(fù)合擴(kuò)增——DNA  pian段分離熒光信號(hào)檢測(cè)——數(shù)據(jù)分析得到的基因分析和圖譜——與數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比和結(jié)果分析——出具數(shù)據(jù)報(bào)告

看到這里，您是否 get 到了細(xì)胞系鑒定的新技能，迫不及待想看看自己冰箱里的細(xì)胞系還是不是當(dāng)初的那個(gè)她呢？