人源化抗體轉(zhuǎn)基因動物的研究進展與趨勢

人源化抗體轉(zhuǎn)基因動物是指利用基因 工程技術(shù)，將動物體內(nèi)的免疫球蛋白基因 用人類的免疫球蛋白基因替換，從而使轉(zhuǎn) 基因動物體內(nèi)的人免疫球蛋白基因發(fā)生 重排和突變，直接表達產(chǎn)生人類的抗體蛋 白，利用轉(zhuǎn)基因動物重排后的人抗體基因 序列或抗體蛋白，通過細胞工程和蛋白質(zhì) 工程技術(shù)手段，制備出臨床使用的人源化 抗體，用于重大疾?。ㄈ缒[瘤）的治療或 突發(fā)性生物安全事件（如SARS、EBOLA 等）的防控。截至2015年底，60余個來源 于轉(zhuǎn)基因動物的人源化抗體進入臨床試驗 階段，其中8個獲得FDA批準進入市場應(yīng) 用。人源化抗體轉(zhuǎn)基因動物已成為抗體開 發(fā)的核心工具動物，對改善人民群眾的健 康水平和保障公共衛(wèi)生安全方面具有重要 的作用和意義。

1　人源化抗體轉(zhuǎn)基因動物的發(fā)展歷程 人源化抗體轉(zhuǎn)基因動物的培育大致

可分為三個不同的發(fā)展階段：代人 源化抗體轉(zhuǎn)基因動物主要以能在動物體 內(nèi)產(chǎn)生人類的抗體蛋白為標志；第二代 人源化抗體轉(zhuǎn)基因動物增加了轉(zhuǎn)入的人 免疫球蛋白基因片段，使人類抗體在動 物體內(nèi)重排多樣性得到進一步增加；第 三代人源化抗體轉(zhuǎn)基因動物重點解決了 轉(zhuǎn)入的人免疫球蛋白基因片段與動物B細 胞發(fā)育的匹配性問題，使得抗體的產(chǎn)量 和質(zhì)量進一步提升。

1.1　代人源化抗體轉(zhuǎn)基因動物

Brüggemann博士于1989年*早報道 人類免疫球蛋白基因能在動物體內(nèi)進行 重排和表達，在技術(shù)上驗證了培育轉(zhuǎn)基 因動物生產(chǎn)人類抗體的可行性1 。隨后， Lonberg小組和Green小組在1994年分別成 功培育出了人源化抗體轉(zhuǎn)基因小鼠，使 培育人源化抗體轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)人類抗 體蛋白成為現(xiàn)實2 3 。

早期的人源化抗體轉(zhuǎn)基因動物直接 將人的免疫球蛋白基因轉(zhuǎn)入動物體內(nèi)， 使其重排產(chǎn)生人類抗體蛋白。但由于動 物會優(yōu)先使用自身的免疫球蛋白基因， 因此轉(zhuǎn)入的人免疫球蛋白基因的重排和 表達受內(nèi)源性免疫球蛋白基因影響較 大，為克服這一問題，培育的代人 源化抗體轉(zhuǎn)基因動物是在轉(zhuǎn)入人免疫球 蛋白基因的同時，對動物內(nèi)源性免疫球 蛋白基因（重鏈、к輕鏈和λ輕鏈）進行 失活4 。

1.2　第二代人源化抗體轉(zhuǎn)基因動物

人免疫球蛋白重鏈（hIgH）基因約 有1250kb，人免疫球蛋白к輕鏈（hIgκ） 基因約1820kb，人免疫球蛋白λ輕鏈 （hIgλ）基因約900kb。要在體外獲得如 此長的基因片段并將其完整導(dǎo)入到動物 體內(nèi)、實現(xiàn)穩(wěn)定遺傳具有較高的技術(shù)難 度。500kb的基因片段是體外基因操作的 極限5 ，因此，代人源化抗體轉(zhuǎn)基因 動物中的人免疫球蛋白基因已進行了改 造，一般轉(zhuǎn)入500kb以下的免疫球蛋白基 因片段，盡管能夠獲得人類抗體蛋白， 但受轉(zhuǎn)入基因片段調(diào)控區(qū)的限制，其重 排多樣性受到制約。

第二代人源化抗體轉(zhuǎn)基因動物是在 代基礎(chǔ)上，重點解決免疫球蛋白超 大基因的穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因、增加人類抗體重排 多樣性的問題。第二代人源化抗體轉(zhuǎn)基 因動物利用胚胎干細胞和基因同源重組技 術(shù)，采用多次介導(dǎo)小片段基因轉(zhuǎn)入和體內(nèi) 同源重組技術(shù)實現(xiàn)了完整的人免疫球蛋白 基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)入，使抗體重排多樣性得到保 障。但這一技術(shù)目前已有保護，進行 商業(yè)化開發(fā)需要獲得許可。

1.3　第三代人源化抗體轉(zhuǎn)基因動物

免疫球蛋白除了能夠重排表達形成 抗體外，在B細胞的發(fā)育過程中也扮演 重要的角色。B細胞發(fā)育早期階段所需 的B細胞受體（B cell receptor，BCR） 由免疫球蛋白重鏈與信號蛋白Igα和Igβ 分子組成。在人源化抗體轉(zhuǎn)基因動物 中，BCR中人的免疫球蛋白重鏈與動物 自身信號蛋白的Igα和Igβ的相互匹配性 并不是*優(yōu)的，因此對B細胞的早期發(fā) 育、B細胞分化抗體類型轉(zhuǎn)換、親和力成 熟都具有重要的影響6 。

為解決以上問題，VelocImmune和 Kymab人源化抗體轉(zhuǎn)基因小鼠僅將小鼠 免疫球蛋白的V區(qū)、D區(qū)和J區(qū)全部替換為 人免疫球蛋白V區(qū)、D區(qū)和J區(qū)，解決早期 B細胞發(fā)育的問題，抗體的表達量和親和力得到進一步的改進，但其產(chǎn)生抗體為 人鼠嵌合抗體，需要二次改造才能形成 全人源化抗體6 7 。2016年，重慶市畜牧 科學院成功培育出中國的人源化抗體轉(zhuǎn) 基因小鼠（CAMouse），其采用時空特異 性表達技術(shù)，在B細胞發(fā)育的早期階段， 免疫球蛋白重排形成鼠源BCR，解決B細 胞發(fā)育的匹配性問題，而在B細胞發(fā)育到 漿細胞階段，免疫球蛋白重排直接表達 形成人類抗體蛋白，這樣轉(zhuǎn)基因小鼠B細 胞的早期發(fā)育、B細胞分化抗體類型轉(zhuǎn) 換、親和力正常。

2　主要人源化抗體轉(zhuǎn)基因動物品系

由于人源化抗體轉(zhuǎn)基因動物培育難度 較大，截至2015年底，全球僅有少數(shù)幾家 單位成功培育出能生產(chǎn)全人源化抗體的轉(zhuǎn) 基因動物，其他抗體研發(fā)公司基本上都是 與以上單位進行合作利用轉(zhuǎn)基因動物研制 人源化抗體。此外，Therapeutic Human Polyclonals Inc（THP）、Ablynx、Origen Therapeutics、Revivicor等公司目前也在利 用兔、駱駝、雞和豬開展人源化抗體轉(zhuǎn)基 因動物的研究，但尚在進行之中，因此本 小節(jié)僅介紹已培育成功的世界主流人源化 抗體轉(zhuǎn)基因動物8 9 。

2.1　XenoMouse 小鼠

XenoMouse小鼠是由Cell Genesys公 司的Green博士領(lǐng)銜培育出的代人源 化抗體轉(zhuǎn)基因小鼠。早期的XenoMouse 轉(zhuǎn)入的人免疫球蛋白基因片段僅含有5個 重鏈V區(qū)和2個к輕鏈V區(qū)，后經(jīng)優(yōu)化升 級，目前XenoMouse攜帶有人IgH和Igк的 主要基因序列，其中人IgH約1.0Mb（含 有34個V區(qū)，23個D區(qū)，6個J區(qū)，以及 Cμ、Cδ），人Igк約0.8Mb（包括32個V 區(qū)，完整的J區(qū)，C區(qū)，KDE，Igк intronic 和3’增強子），而小鼠自身的IgH和Igк已 被失活。該品系小鼠可以識別人類的蛋 白作為抗原，產(chǎn)生體液免疫反應(yīng)。利用 XenoMouse小鼠，從體內(nèi)免疫到利用雜交 瘤技術(shù)篩選出人源化抗體，只需3個月的 時間，篩選出的抗體親和力可達pM10。1996 年，Cell Genesys公司將XenoMouse小鼠 業(yè)務(wù)分拆出來成立Abgenix公司，2005 年，Amgen公司花費22億美元，收購Abgenix 公司11。

2.2　UltiMab 小鼠

UltiMab小鼠與XenoMouse小鼠同步 出現(xiàn)，由美國Medarex公司Lonberg博士 領(lǐng)銜培育而成。UltiMab小鼠與XenoMouse 小鼠性質(zhì)類似，轉(zhuǎn)入了人IgH和 Igк的主要基因，同時使小鼠自身的IgH和 Igк失活，差異在于UltiMAb小鼠采用原 核注射的方式培養(yǎng)，而XenoMouse采用酵 母原生質(zhì)融合的方式培育而成2 。Ulti- MAb小鼠經(jīng)過幾代的發(fā)展，已由*初的3 個重鏈V區(qū)、4個к輕鏈V區(qū)發(fā)展成能產(chǎn)生 所有抗體亞型的人源化抗體轉(zhuǎn)基因小 鼠，并開發(fā)了30余個抗體藥物進入臨床試驗4 。2009年，百時美施貴寶支付 24億美元收購Medarex公司12。

2.3　Harbour 小鼠

Harbour公司目前擁有H2L2和 HCAB兩個品系的小鼠。H2L2小鼠內(nèi) 源性的抗體表達被失活，同時轉(zhuǎn)入了 嵌合的人/大鼠/小鼠的免疫球蛋白基 因。其轉(zhuǎn)入的免疫球蛋白重鏈基因包 括18個人的V區(qū)，19個人的D區(qū)，6個 人的J區(qū)，大鼠的C區(qū)及小鼠的LCR 區(qū)，轉(zhuǎn)入的免疫球蛋白к輕鏈包括11 個人的V區(qū)，5個人的J區(qū)，1個大鼠的 C區(qū)，同時在大鼠C區(qū)的兩側(cè)各有1個 小鼠的增強子。其產(chǎn)生的抗體親和力 可達（p～n）Molar。HCAB品系為單 鏈特異性抗體轉(zhuǎn)基因小鼠，小鼠自身 的重鏈C區(qū)和к輕鏈被敲除，轉(zhuǎn)入的人 免疫球蛋白重鏈基因部分包括8個人 V3區(qū)，1個人V6區(qū)，人AIID區(qū)和6個 人的J區(qū)，同時還帶有小鼠Cγ和小鼠 LCR區(qū)。該品系小鼠可用于雙功能抗 體和四價抗體的開發(fā)13。

2.4　OmniAb

OmniAb目前擁有3個不同品系的 人源化抗體轉(zhuǎn)基因動物，即Omni- Rat、OmniMouse以及OmniFlic，由英 國Marianne Brüggemann博士主導(dǎo)培育 而成。OmniRat攜帶有嵌合的人／大 鼠免疫球蛋白重鏈基因（包括22個人 V區(qū)，所有的人D區(qū)和J區(qū)，以及大鼠 的C區(qū)）和人的免疫球蛋白輕鏈（12 個人к輕鏈V區(qū)和Jk-Ck，16個人λ輕鏈 V區(qū)和Jλ-Cλ），同時利用鋅指核酸酶 對大鼠內(nèi)源性免疫球蛋白基因進行滅 活。OmniRat具有正常大鼠相近的免 疫功能，免疫1只OmniRat，通過雜交 瘤技術(shù)可獲得約1600個克隆，其中陽 性克隆為148個（正常SD大鼠約可獲 得3520個克?。?OmniMouse小鼠培 養(yǎng)方式與OmniRat類似，但其攜帶的 人免疫球蛋白V區(qū)要多于OmniRat。 OmniFlic是用于單鏈抗體開發(fā)的人源 化抗體轉(zhuǎn)基因大鼠，與OmniRat相 比，僅在人免疫球蛋白輕鏈方面存在 差異，OmniFlic僅攜帶有重排后的單 個Vk-Jk-Ck，其可避開雜交瘤技術(shù)獲 得抗體基因的相關(guān)信息14。2013年， 藥明康德宣布引入OmniRat開展人源 化抗體合作研究15。

2.5　VelocImmune 小鼠

VelocImmune小鼠是美國Regeneron 公司培育的人源化抗體轉(zhuǎn)基因小 鼠，其將小鼠IgH和Igк的V區(qū)精確地 替換為對應(yīng)的人IgH和Igк的V區(qū)，保 留了小鼠自身的所有C區(qū)及其他基因 表達調(diào)控元件。通過連續(xù)三次同源重 組，VelocImmune小鼠*終攜帶了人 IgH的80個V區(qū)和Igк的40個V區(qū)。該小 鼠具有正常小鼠類似的免疫反應(yīng)特性 和抗體產(chǎn)量，已開發(fā)了10余種抗體進 入臨床試驗階段，但該小鼠存在的問 題是產(chǎn)生的抗體是人鼠嵌合抗體，需 要進行二次改造才能實現(xiàn)全人源化7 。

2.6　Kymab 小鼠

Kymab小鼠由英國Kymab公司和 Sanger研究所共同培育而成，其構(gòu)建 策略與VelocImmune小鼠類似，也是將 小鼠IgH和Igк的V區(qū)精確地替換為對應(yīng) 的人IgH和Igк的V區(qū)，保留了小鼠自身 的所有C區(qū)及其他基因表達調(diào)控元 件6 。細微的差別是VelocImmune小鼠 采用的經(jīng)典的同源重組策略實現(xiàn)完整 的V區(qū)替換，而Kymab是采用的Cre介 導(dǎo)的同源重組技術(shù)實現(xiàn)完整的V區(qū)替 換，雙方的沖突較大，2016年 10月，英國Kymab公司宣布與中國岸 邁生物科技有限公司進行技術(shù)互相授 權(quán)及合作16 。

2.7　CAMAB 小鼠

CAMAB小鼠由中國重慶市畜牧 科學院培育而成，包括兩類抗體小 鼠：CAMouseHG生產(chǎn)全人源抗體， CAMouseH生產(chǎn)全人源單域抗體（全 人源納米抗體）。CAMouse小鼠攜帶 有經(jīng)改造的人免疫球蛋白重鏈、人免 疫球蛋白к輕鏈和λ輕鏈基因，同時對 小鼠內(nèi)源性免疫球蛋白基因進行了滅 活。CAMouseHG 和CAMouseH的 特點是具有人/小鼠免疫球蛋白時空 轉(zhuǎn)換表達特性，在B細胞發(fā)育的早期 階段，形成鼠源BCR結(jié)構(gòu)，確保小鼠 B細胞的正常發(fā)育，在B細胞發(fā)育至 漿細胞階段，則又利用人源的Gamma 區(qū)進行重排和表達，生產(chǎn)人源IgG。 CAMouse小鼠的B細胞發(fā)育正常，抗 體表達量高，重排多樣性豐富，根據(jù) 目標抗體的需要，可以選擇使用抗體 小鼠。

3　人源化抗體轉(zhuǎn)基因動物的應(yīng)用

2006年，利用XenoMouse開發(fā)的 panitumumab獲得美國FDA批準進入 臨床使用，這是個獲批的來源于 轉(zhuǎn)基因動物的人源化抗體，截至2015 年底，共有8個來源于轉(zhuǎn)基因動物的 人源化抗體獲得FDA批準（表1）， 適應(yīng)證主要以腫瘤和自身免疫疾病治 療為主， 包括明星抗體P D - 1 與 CTLA-4抗體，均由轉(zhuǎn)基因動物開發(fā) 而來，目前來源于轉(zhuǎn)基因動物的抗 體全球年銷售額已超過30億美元。 自1996年以來，共有130余個人源化 抗體進入臨床試驗，其中利用人源 化抗體轉(zhuǎn)基因動物共開發(fā)了60余種 治療性抗體，約占全部人源化抗體 的一半，已有21個完成臨床試驗， 22個在進行臨床試驗（7個Ⅰ期，14 個Ⅱ期，1個Ⅲ期）。根據(jù)統(tǒng)計，來 源于轉(zhuǎn)基因動物的全人源化抗體從 Ⅱ期到Ⅲ期以及從Ⅲ期到獲得FDA 許可的比例要高于其他方法制備的 人源化抗體17。

4　人源化抗體轉(zhuǎn)基因動物 未來發(fā)展展望

隨著基因編輯技術(shù)的快速發(fā)展， 未來將會在越來越多的物種上培育出 人源化抗體轉(zhuǎn)基因動物，其功能特性 也將日趨完善，但相關(guān)保護則是 在培育人源化抗體轉(zhuǎn)基因動物初期就 需要優(yōu)先考慮的問題。在相當長的一 段時間內(nèi)，人源化抗體轉(zhuǎn)基因動物仍 將是人源化抗體開發(fā)的一項核心技 術(shù)，而人源化抗體轉(zhuǎn)基因大動物和單 鏈抗體轉(zhuǎn)基因動物將是對現(xiàn)有人源化 抗體轉(zhuǎn)基因動物的重要補充18。 人源化抗體轉(zhuǎn)基因大動物在短期 內(nèi)可以大量產(chǎn)生特異性抗體，在公共 安全事件防控方面具有重要的作用。 盡管日本Kyowa Hakko Kirin公司已培 育出全人源化轉(zhuǎn)基因牛，但由于其采 用的技術(shù)存在一定的缺陷，難以穩(wěn)定 遺傳，目前尚無法正常使用，需要進 一步完善19。在培育大型轉(zhuǎn)基因動物 時，除了通用技術(shù)外，還需要考慮其 繁殖性能、生物凈化難易程度等特 性。綜合考慮，利用豬和兔等大型 或高繁殖性能的動物將是未來的重 要補充。

來源于駝科的單鏈抗體轉(zhuǎn)基因 動物由于分子量小，穿透力強，能夠 通過常規(guī)抗體無法到達的部位，具有 重要的醫(yī)藥價值，已受到廣泛的關(guān) 注。目前，已有多家單位開展單鏈抗 體轉(zhuǎn)基因動物的培養(yǎng)，相信這一領(lǐng)域 近期內(nèi)會取得越來越多的進展。