檢測抗原特異性 T 細(xì)胞的金標(biāo)準(zhǔn)---MHC 四聚體檢測技術(shù)

       MHC 四聚體（MHC Tetramer）是一類免疫學(xué)試劑，由四個主要組織相容性復(fù)合體（Major Histocompatibility Complex，MHC）與抗原肽結(jié)合的單體分子組成，并標(biāo)記有熒光，用于 T 細(xì)胞免疫分析的 MHC 四聚體檢測（MHC Tetramer Assay，或稱 MHC Tetramer Stain）。

檢測原理 & 應(yīng)用領(lǐng)域

        MHC 四聚體檢測技術(shù)于 1996 年由美國斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院的 John D. Altman 博士所開發(fā)， 它在單細(xì)胞水平上標(biāo)記目標(biāo) T 細(xì)胞，并通過流式細(xì)胞術(shù)對細(xì)胞進(jìn)行分析，從而成為一種快速、簡便的檢測抗原特異性 T 細(xì)胞（antigen-specific T cells）的定性及定量分析方法。與其他應(yīng)用于 T 細(xì)胞檢測的方法如胞內(nèi)細(xì)胞因子染色法（ICS）、酶聯(lián)免疫斑點檢測法（ELISPOT）等相比， MHC 四聚體技術(shù)具有高靈敏度、高特異性、定量分析簡便且重復(fù)性高等優(yōu)點，在腫瘤、感染、自身免疫性疾病等研究領(lǐng)域被越來越多地運用于：

細(xì)胞分選——特異性 T 細(xì)胞高效分選

抗原表位研究——抗原表位短肽親和力篩選

病毒逃逸研究——病毒逃避免疫機(jī)制研究

細(xì)胞治療研究——T 細(xì)胞表面受體 TCR 親和力研究u 抗體篩選研究——「T-Cell Receptor-Like Antibodies」篩選研究uMHC 免疫功能研究——利用混合抗原表位片段鑒定 MHC 免疫功能

HelixGenTM MHC 四聚體試劑染色步驟

 HelixGen TM MHC 四聚體產(chǎn)品，能快速、簡便地實現(xiàn)對抗原特異性 T 細(xì)胞（Antigen-specific T cells）的定性與定量分析。

（一）所需主要試劑和設(shè)備

1）欲檢測的細(xì)胞或全血；

2）熒光染料標(biāo)記 Anti-CD8 抗體或其它抗體；

3）離心機(jī)、流式細(xì)胞分選儀等。

（二）基本操作流程

細(xì)胞準(zhǔn)備

1. 外周血單核細(xì)胞、脾細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、常規(guī)細(xì)胞系細(xì)胞等，以 2-5×107/ml 的密度重懸于 FACS Buffer（PBS+ 2% 小牛血清+0.1% 疊氮鈉；建議使用時新鮮配制），制備成細(xì)胞懸浮液。

2. 取 25ul 細(xì)胞懸浮液滴加入微孔培養(yǎng)板或 FACS 試管。

Staining Cocktail 制備

3. 制備 2X Staining Cocktail：FACS Buffer+ MHC 四聚體（建議稀釋比例為 1:50～1:100）+ Anti-CD8/FITC 抗體或其他用作內(nèi)參的抗體（請參考其說明書進(jìn)行稀釋）。

染色孵育

4. 取 25ul 2X Staining Cocktail，滴加入步驟 2 中的微孔培養(yǎng)板或 FACS 試管，與細(xì)胞懸浮液混勻。（注意：使用移液器輕柔上下吹打混勻，盡可能避免產(chǎn)生氣泡。）

5. 在冰上或其他已通過實驗優(yōu)化確認(rèn)的最佳溫度條件下，避光孵育 60 分鐘。

洗滌

6. 加入 150ul FACS Buffer 至微孔培養(yǎng)板每孔或 2-3 ml FACS Buffer 至 FACS 試管，輕柔混勻，避免形成氣泡，1200 rpm 離心 5 min，小心除去上清液，盡可能不要觸碰到細(xì)胞沉淀，減少細(xì)胞損失。（注意：對于具有傳染性或危害性的樣本，可考慮使用吸引器，輕柔吸掉上清液，盡可能不要觸碰到細(xì)胞沉淀，減少細(xì)胞損失。）

7. 重復(fù)步驟 6，再洗滌 2 次。

細(xì)胞固定 & 流式分析

8. 將細(xì)胞重懸于 200 ul 固定液（PBS+1% 多聚甲醛（PFA））中，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行樣本分析。