我的石蠟切片又「團(tuán)滅」了！沒(méi)關(guān)系，專業(yè)技術(shù)人員與您并肩推塔！

前期準(zhǔn)備

在經(jīng)過(guò)前期與馬同學(xué)的討論后，決定在這次測(cè)試中，對(duì)原 protocol 進(jìn)行如下重大調(diào)整：

1. 測(cè)試時(shí)增加陽(yáng)性/陰性對(duì)照片（Control slides：SignalSlide^? PD-L1 IHC Controls #13747），確保抗體和染色結(jié)果的特異性；

2. 將高壓修復(fù)法調(diào)整為微波修復(fù)法；

3. 使用 CST 的 EDTA 修復(fù)液；根據(jù) CST 的 protocol，增加修復(fù)液的用量（適用組化修復(fù)缸，用量為200 mL/次），且修復(fù)后不冷卻切片；

4. 使用全套 CST 輔助試劑，即 ImmunohistochemistryApplication Solutions Kit (Rabbit) #13079，確保體系的穩(wěn)定性。

(左) CST技術(shù)人員與馬同學(xué)共同討論實(shí)驗(yàn)。(右)本次實(shí)驗(yàn)使用的修復(fù)缸

實(shí)驗(yàn)步驟

脫蠟與水化

1. 二甲苯脫蠟：3 × 5 min。（為確保測(cè)試時(shí)二甲苯新鮮，使用新的二甲苯）

2. 乙醇水化：100% 乙醇2 × 10 min；95% 乙醇，2 × 10 min。

3. 洗滌：切片浸沒(méi)于ddH2O中，3 ×5 min。

抗原修復(fù)

4. 修復(fù)：使用200 mL ddH2O稀釋后的SignalStain^? EDTA Unmasking Solution#14747進(jìn)行修復(fù)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)室微波爐的實(shí)際情況，高火檔加熱2 min45sec后煮沸，立即換保溫檔，保溫15 min。修復(fù)后切片不冷卻，直接進(jìn)行下一步。

5. 洗滌：切片浸沒(méi)于dH2O中，3 ×5 min。

去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶

6. 3% 過(guò)氧化氫處理切片，加蓋室溫放置15 min。（加蓋的目的是為了防止過(guò)氧化氫與空氣接觸后并不穩(wěn)定）

7. 洗滌：切片浸沒(méi)于dH2O中，2 ×5 min。

8. 緩沖液轉(zhuǎn)換：切片浸沒(méi)于TBST中，1 ×5 min。

封閉與一抗孵育

9. 配置封閉液（Animal-Free Blocking Solution #15019），滴加在切片上，室溫靜置1 h。（此步建議一張張完成，防止干片）

10. 配置一抗：使用SignalStain^? Antibody Diluent #8112 稀釋PD-L2抗體（#82723）稀釋度為1：200。

11. 橫瀝封閉液，用衛(wèi)生紙盡量吸干封閉液后，將一抗滴加在切片上。（此步建議一張張完成，防止干片）

12. 將濕盒小心移入4度冰箱，過(guò)夜。

CST技術(shù)人員正在配置和滴加抗體

二抗孵育與顯色

13. 小心取出濕盒，在室溫平衡45分鐘左右。

14. 洗滌：切片浸沒(méi)于TBST中，3 ×5 min。

15. 將二抗SignalStain^? Boost IHC Detection Reagent (HRP, Rabbit)#8114 滴加于切片上，室溫孵育40 min。

16. 洗滌：切片浸沒(méi)于TBST中，3 ×5 min。

17. 配置顯色液：將一滴SignalStain^? DAB Chromogen Concentrate（約30ul）加入1 mL SignalStain^? DAB Diluent中，混勻。

18. 將顯色液滴加于切片上，于顯微鏡（10倍目鏡）下觀察染色情況，待看到棕黃色陽(yáng)性沉積，且背景不深時(shí)，將切片浸沒(méi)于ddH2O中，終止染色。

19. 按實(shí)驗(yàn)室常規(guī)步驟復(fù)染核、封片。

測(cè)試結(jié)果

使用PD-L2的陽(yáng)性對(duì)照切片SignalSlide^? PD-L1 IHC Controls #13747，在陽(yáng)性細(xì)胞團(tuán)中見(jiàn)到陽(yáng)性染色，在陰性細(xì)胞團(tuán)中未見(jiàn)染色，提示抗體適用于石蠟切片，且特異性佳。

使用PD-L2(D7U8C^TM ) XP^? RabbitmAb( #82723)在對(duì)照切片SignalSlide^? PD-L1 IHC Controls（#13747）上的HDLM-2陽(yáng)性細(xì)胞團(tuán)（左）和PC-3陰性細(xì)胞團(tuán)（右）進(jìn)行免疫組化染色

在馬同學(xué)的人淋巴結(jié)石蠟切片上，也觀察到了陽(yáng)性染色。

使用 PD-L2(D7U8C^TM) XP^? RabbitmAb( #82723)在客戶提供的人淋巴結(jié)石蠟切片上進(jìn)行免疫組化染色

編后記

科研實(shí)驗(yàn)向來(lái)不是「躺贏局」，必須是「盡力局」：Victory 固然好，Defeat 也不用氣餒，分析戰(zhàn)后數(shù)據(jù)，調(diào)整實(shí)驗(yàn)方案和策略，下一次「匹配」開(kāi)始后又是一場(chǎng)全新的戰(zhàn)斗。