細菌的培養(yǎng)

一、目的

學習細菌的培養(yǎng)方法及培養(yǎng)基的配置。

二、原理

在基因工程實驗和分子生物學實驗中，細菌是不可缺少的實驗材料。質(zhì)粒的保存、增殖和轉(zhuǎn)化；基因文庫的建立等都離不開細菌。特別是常用的大腸桿菌。

大腸桿菌是含有長約3000kb的環(huán)狀染色體的棒狀細胞。它能在僅含碳水化合物和提供氮、磷和微量元素的無機鹽的培養(yǎng)基上快速生長。當大腸桿菌在培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，其開始裂殖前，先進入一個滯后期。然后進入對數(shù)生長期，以20~30min復(fù)制一代的速度增殖。最后，當培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分和氧耗盡或當培養(yǎng)基中廢物的含量達到抑制細菌的快速生長的濃度時，菌體密度就達到一個比較恒定的值，這一時期叫做細菌生長的飽和期。此時菌體密度可達到1×10⁹~2×10⁹/mL。

培養(yǎng)基可以是固體的培養(yǎng)基，也可以是液體培養(yǎng)基。實驗室中最常用的是LB培養(yǎng)基。

三、實驗材料、試劑與主要儀器

（一） 實驗材料

大腸桿菌

（二） 試劑

1、胰蛋白胨

2、酵母提取物

3、氯化鈉

4、1mol/LNaOH

5、瓊脂粉

6、抗生素（氨芐青霉素、卡那霉素等）

（三）儀器

1、培養(yǎng)皿

2、帶帽試管

3、涂布器

4、滅菌鍋

5、無菌操作臺（含酒精燈、接種環(huán)、滅菌牙簽等）

6、恒溫搖床

四、操作步驟

（一）LB培養(yǎng)基的配制

配制每升培養(yǎng)基，應(yīng)在950m1去離子水中加入：

細菌培養(yǎng)用胰蛋白胨 10g

細菌培養(yǎng)用酵母提取物 5g

NaCl 10g

搖動容器直至溶質(zhì)完全溶解，用1mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH位至7.0。加入去離子水至總體積為lL，在15 lbf／in² (1.034×10⁵Pa)高壓下蒸氣滅菌20min，即為LB液體培養(yǎng)基。

LB固體培養(yǎng)基是在其液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上另加瓊脂粉15g/L。

（二）細菌的培養(yǎng)

（１）在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)

 

1、過夜培養(yǎng)

⑴取5ml液體培養(yǎng)基加入一只無菌的試管中。

⑵用接種環(huán)或滅菌牙簽挑一個單菌落，接種于培養(yǎng)液中。

⑶蓋好試管，在搖床上以60r/min速度，于37℃過夜培養(yǎng)。

２、大體積培養(yǎng)

⑴按1∶100的比例將過夜培養(yǎng)物加入到一無菌燒瓶中，燒瓶的體積應(yīng)該是培養(yǎng)液體積的5倍以上。

⑵于37℃，約300r/min劇烈搖動培養(yǎng)。

（２）在固體培養(yǎng)基中培養(yǎng) 細菌在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)主要是為了獲得單菌落和短期保存。

平板劃線法分離單菌落

⑴采用無菌技術(shù)，用接種環(huán)將接種物從平板的一側(cè)開始劃線。

⑵重新消毒接種環(huán)，從第一劃線處將樣品劃線至平板的其余部分，重復(fù)劃線直至覆蓋整個平板。

⑶于37℃培養(yǎng)直至長出單菌落。

 

 

水平式瓊脂糖凝膠電泳法檢測DNA

目的

學習水平式瓊脂糖凝膠電泳，檢測DNA的純度，DNA的構(gòu)型，含量以及分子量的大小。

原理

水平式瓊脂糖凝膠電泳是基因工程操作中最常規(guī)的實驗方法，它簡單易行，只需少量的DNA就能檢測，其分辨效果比分光光度計法與溴化乙啶-標準濃度DNA比較法更高，更直接，檢測DNA范圍更廣，其原理是溴化乙啶在紫外光照射下能發(fā)射熒光，當DNA樣品在瓊脂糖凝膠中電泳時，瓊脂糖凝膠中的EB就插入DNA分子中形成熒光絡(luò)合物；使得DAN發(fā)射的熒光，增強幾十倍。而熒光的強度正比于DNA的含量，如將已知濃度的標準樣品做瓊脂糖凝膠電泳的對照，就可比較出待測樣品的濃度。若用薄層分析掃描儀檢測，則可精確地測得樣品的濃度。電泳后的瓊脂糖凝膠塊直接在紫外光下照射拍照，只需5~10ng DNA ，就可以從照片上比較鑒別。如肉眼觀察，可檢測到0.01~0.1ng的DNA。

在凝膠電泳中，DNA分子的遷移速度與分子量的對數(shù)值成反比。質(zhì)粒DNA樣品用單一切點的酶酶切后與已知分子量大小的標準DNA片段進行電泳對照，觀察其遷移距離，就可以該樣品的分子量大小。凝膠電泳不僅可分離不同分子量的DNA，也可鑒別分子量相同，但構(gòu)型不同的DNA分子。在抽提質(zhì)粒的過程中，由于各種因素的影響，使得超螺旋共價閉環(huán)結(jié)構(gòu)的DNA（SC）的一條鏈斷裂，變成開環(huán)（OS）分子，如果兩條鏈發(fā)生斷裂，就變成線形分子（L）分子。這三種構(gòu)型的分子有不同的遷移率。在一般情況下，超螺旋遷移速度最快，其次為線形分子，最慢的為開環(huán)分子。

當提取到的質(zhì)粒DNA樣品中還有染色體DNA或RNA，在瓊脂糖電泳上也可以分別觀察到電泳區(qū)帶，由此可以分析樣品的純度。

DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時，有電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)，前者由分子所帶凈電荷的多少而定，后者則主要與分子大小及構(gòu)型有關(guān)。DNA分子在高于其等電點的溶液中帶負電荷。在電場中向著正極移動，在用電泳法檢測DNA分子時，應(yīng)當盡量減少電荷效應(yīng)。增加凝膠的濃度可以在一定程度上降低電荷效應(yīng)，使得分子的遷移速度主要由分子受凝膠阻滯程度差異所決定，提高分辨率。同時適當降低電泳時的電壓，也可以使分子篩效應(yīng)相應(yīng)增強而提高分辨率。

試劑與器材

一、試劑

1、 DNA樣品

2、 TBE緩沖液（5×）：用時需稀釋10倍

3、 點樣緩沖液Loading buffer（10×）：0.25%溴酚藍，40%甘油

4、 溴乙啶染色液(EB)：10mg/ml溴乙啶 注意：該試劑具致癌作用，用時要小心。

5、 瓊脂糖

二、器材

1、 電泳儀系統(tǒng)

2、 紫外燈

3、 恒溫水浴箱

 

操作步驟

1． 選擇合適的水平式電泳儀，調(diào)節(jié)電泳槽平面至水平，檢測穩(wěn)壓電源與正負極的線路。

2． 選擇孔徑大小適宜的點樣梳，垂直架在電泳槽負極的一端，使得點樣梳的底部與電泳槽水平面的距離為0.5~1.0mm。

3． 制備瓊脂糖凝膠：按照被分離的DAN分子的大小，決定凝膠中瓊脂糖的百分含量。一般情況下可參考下表：

瓊脂糖的含量（%） g/ml	分離線狀DNA分子的有限范圍(kb)
0.3	60~5
0.6	20~1
0.7	10~0.8
0.9	7~0.5
1.2	6~0.4
1.5	4~0.2
2.0	3~0.1

稱取瓊脂糖溶解在電泳緩沖液中，一般配制約40ml 凝膠液，置微波爐中或水浴加

熱，至瓊脂糖融化均勻。

4． 將凝膠槽洗凈擦干，兩端用膠布封好，在一端插好梳子。待凝膠溶液冷卻至60℃

左右時，在凝膠溶液中加EB（EB最終濃度為0.5 μg/ml），搖勻，輕輕倒入電泳槽水平板上，除掉氣泡。待凝膠完全凝固后，去掉兩端封條，將凝膠槽移至電泳槽（槽中已加入TBE緩沖液），然后小心地拔掉梳子保持點樣孔完整。

注意：電極緩沖液要高出凝膠面2-5㎜。

5． 待測的DNA樣品中，加入1/5體積的點樣緩沖液，混勻后小心的進行點樣，記錄樣

品點樣順序和點樣量。

6． 開啟電源開關(guān)，最高電壓不超過5V/cm。

7． 電泳時間看實驗的具體要求而異，在電泳中途可用紫外燈直接觀察，DNA各條區(qū)帶

分開后電泳結(jié)束。一般20min—3 h，取電泳凝膠塊直接拍照。

 

 

RNA提取與純化

一、目的

掌握RNA提取的基本技術(shù)，了解RNA提取過程中的各種注意事項。

二、原理

RNA提取是分子生物學實驗中難度較大的實驗技術(shù)。

RNA提取和DNA提取有類似的地方，因為它們都是核酸，都具有較好的水溶性。提取RNA首先破碎細胞，然后用提取液將RNA溶出，反復(fù)抽提去除蛋白質(zhì)，加入乙醇沉淀RNA，將RNA沉淀溶解備用。那么如何區(qū)分DNA和RNA分開？DNA和RNA的溶解性不同，DNA在1M的鹽溶液中具有最好的溶解度，而RNA在0.14M的鹽溶液中具有最好的溶解度，所以可以利用它們的溶解性將它們進行區(qū)分。另外，RNA的分子量一般比較小，而DNA分子很大且和蛋白結(jié)合成復(fù)合體，所以DNA更容易隨蛋白沉淀，而RNA具有較好的溶解性。

RNA提取的另一個關(guān)鍵問題就是如何抑制或去除環(huán)境中RNA酶。所有的玻璃、陶瓷和鐵器具在180℃×6 h以上。所有的塑料器皿用0.1％的DEPC水37℃過夜浸泡，然后濕熱滅菌80℃烘干備用。配制溶液所需的水也要用DEPC處理過的水，而配置Tris相關(guān)的緩沖液時Tris會與DEPC發(fā)生反應(yīng)，應(yīng)避免用DEPC處理。另外操作過程中應(yīng)戴手套。

判斷RNA 的質(zhì)量主要有兩個標準，一是純度，二是完整性（是否被降解）。RNA的純度可以通過分光光度計進行測定的A260／A280值來判斷。RNA的完整性主要通過電泳分析來闡明，未降解的總RNA電泳時在凝膠中會出現(xiàn)18S和28SrRNA對應(yīng)的條帶（如果有DNA污染則在RNA后會發(fā)現(xiàn)基因組DNA對應(yīng)的條帶）。RNA電泳系統(tǒng)也要嚴格對RNA酶進行處理。如果用普通瓊脂糖凝膠電泳，則用盡量減少電泳時間。

三、試劑與器材

（一）試劑

1、暗培養(yǎng)7天的小麥苗，用前光照誘導(dǎo)3 h

2、DEPC

3、DEPC處理的ddH₂O

4、RNA提取液：（每1000毫升中含有）

Tris 6.06 克 (最終濃度為50 mM )

LiCl 6.03 克 (LiCl -H₂O9.06克) (最終濃度為150 mM )

EDTA（0.5 M） 10 毫升 (最終濃度為5 mM )

SDS 50 克 (最終濃度為5 % )

5、8 M Li Cl：33.92克Li Cl 溶于100 ml DEPC處理的ddH₂O

1、 水飽和酚

2、 氯仿

3、 0.5M NaCl

4、 溴乙啶(EB)： 10mg/ml溴乙啶。 注意：該試劑具致癌作用，用時要小心。

10、點樣緩沖液Loading buffer（10×）：0.25%溴酚藍，40%甘油。

二、器材

1、 分光光度計

2、 電泳儀

3、 臺式離心機

4、 手提式紫外監(jiān)測儀

5、 恒溫水浴

6、 凝膠成像系統(tǒng)

四、操作步驟

1、取植物葉片1-3克，放在液氮中磨成粉末。(可以多研磨一些，然后分裝，小量提取試劑量可減至1／10)

2、液氮揮發(fā)完之前，倒入含有10 毫升RNA提取液的離心管中，迅速反復(fù)倒置混勻，直至看不見任何團狀物為止。

3、立即加入10毫升的等體積（酸性）酚/氯仿，劇烈（?。┓磸?fù)倒置混勻5至10min（如在震蕩器上震蕩，要確?；靹蚨荒軆H僅是振動！）。

4、13000g×5min，吸管取上清（注意避免吸取界面上的蛋白）。

5、重復(fù)步驟3和4，三次左右（注意觀察界面上白色物質(zhì)）。

6、取上清，加入等體積的氯仿，反復(fù)倒置混勻2-5min。

7、13000g×5min。

8、取上清，加入1/3體積8 M 的 LiCl （即8 M LiCl應(yīng)占最后體積的25%）， 沉淀RNA，4℃過夜。

9、離心13000g × 10 min。

10、棄上清,保留沉淀（此時應(yīng)把RNA沉淀轉(zhuǎn)入Eppendorf管中，以便于操作）, 加入70%無水乙醇+30% 0.5 M NaCl 的混合液0.5 毫升洗滌沉淀數(shù)分鐘（和緩地反復(fù)倒置混勻），離心 （13000g × 2 min）。重復(fù)洗滌沉淀數(shù)次。

11、用70%乙醇再洗滌2次沉淀，去掉鹽離子。

12、用槍頭吸去殘留的液體，真空干燥2min。

13、加入200ulDEPC 處理過的水溶解RNA。

14、取用5ul電泳檢測RNA完整性, 用TEB 緩沖液, 200V× 20-30min。

15、取5 ul稀釋40倍測定RNA純度和濃度，A260 nm /A280 nm應(yīng)在 2.0 左右。

16、將RNA 分裝,放在-70℃長期保存?zhèn)溆?

輔助方案：試劑盒提取法（Trizol）

（一）試劑：

1.Ttizol Reagent

2.氯仿

3.異丙醇

4.70%無水乙醇

5.DEPC

（二）器材：

1、研缽

2、離心機

（三）實驗步驟

1、稱取小麥葉片50-100mg,于研缽中加液氮研磨成粉末，迅速轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中。

2、加入1 ml Trizol Reagent，15～30℃×5min。

3、加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩15 sec，15～30℃×3min。

4、冷凍離心12 000 rpm×15min。

5、將上清液轉(zhuǎn)移到另一個離心管中，加0.5ml預(yù)冷異丙醇,混勻 ，-20℃放置20min。

6、冷凍離心12 000 rpm×10min。

7、加入0.5ml 70% 乙醇洗RNA沉淀，懸浮，7500 rpm×2min，除去乙醇。

加入30 ul DEPC 處理過的ddH₂O溶解RNA。

 

 

感受態(tài)細胞的制備及轉(zhuǎn)化

目的

掌握感受態(tài)細胞制備和轉(zhuǎn)化的基本方法。

原理

受體細胞經(jīng)過一些特殊方法如電擊法, 化學試劑法（CaCl2 ,RbCl，KCl)等的處理后,細胞膜的通透性發(fā)生了暫時性的改變,成為能允許外源DNA分子進入的感受態(tài)細胞。

試劑與器材

一、試劑

1、0.1mol/L CaCl₂取20ul PCR產(chǎn)物進行1.2%瓊脂糖電泳分析。

2、LB液體培養(yǎng)基（見實驗一）

3、LB固體培養(yǎng)基（見實驗一）

4、氨芐青霉素（100mg/mL）

二、器材

1、 冷凍離心機

2、 平衡天平

3、 無菌操作臺

4、 微量移液器

操作步驟

一.感受態(tài)細胞的制備(0.1MCaCl₂方法)

1、從LB固體平板挑單克隆于5ml LB液體培養(yǎng)基中(不加抗生素)，37℃×200rpm×12-16h，可過夜培養(yǎng)。

2、將活化菌體按1`～5％接種到LB中，擴大培養(yǎng)37℃×200rpm×2h，至OD₆₀₀約為0.4。

3、取培養(yǎng)好的菌液1.5 ml于一離心管中，4℃離心8 000rpm×1 min。

4、棄上清，加500 ul 0.1M CaCl₂ (滅菌預(yù)冷)洗菌體，4℃冷凍離心8000rpm×1 min。

5、徹底除去殘液, 加200 ul 0.1M CaCl₂ (滅菌預(yù)冷)，懸浮菌體。

6、冰浴靜置 30 min ，4℃冷凍離心8000rpm×1 min。

7、棄上清，加100 ul 0.1M CaCl₂ (滅菌預(yù)冷)，懸浮菌體，即為制備好的感受態(tài)細胞。

附注：

①、整個過程注意無菌操作和保持低溫。

②、培養(yǎng)物處于對數(shù)生長期是制備感受態(tài)細胞的關(guān)鍵。

③、如果要求高轉(zhuǎn)化效率，不建議使用簡單深凍保存的感受態(tài)細胞。

④、LB液體培養(yǎng)基建議用不加抗生素和加抗生素的兩種培養(yǎng)基，檢查菌體是否污染。

⑤、D₆₀₀值指細胞密度，用于判斷培養(yǎng)物是否處于對數(shù)生長期。OD₆₀₀值在0.4 - 0.5時，此時培養(yǎng)物處于對數(shù)生長期，細胞數(shù)在20min內(nèi)加倍。

二、質(zhì)粒對大腸桿菌的轉(zhuǎn)化

1、將連接產(chǎn)物加入100 ul制備好的感受態(tài)細胞，冰上放置30 min。

2、42℃熱激90S。

3、迅速冰浴3min。

4、加入300 ul LB液體培養(yǎng)基，37℃輕搖培養(yǎng)45min。

5、加入30 ul X-gal和6 ulIPTG,混勻。

6、取100 ul涂布在含有50 ug/ml氨芐的LB固體培養(yǎng)基中。

7、37℃倒置，避光培養(yǎng)16-20 h。

8、藍白斑篩選，挑取單菌落進行菌落PCR鑒定。