舊瓶裝新酒：核酸純化最近有哪些新亮點(diǎn)？

在臨床或科研實(shí)驗(yàn)室中，各種各樣的樣本在等待著核酸提取，包括常規(guī)的血液和細(xì)胞，新鮮、冷凍或陳舊的組織活檢樣本，以及環(huán)境或農(nóng)業(yè)應(yīng)用中的土壤或植物樣本。提取是否成功，是決定下游實(shí)驗(yàn)?zāi)芊耥樌_(kāi)展的關(guān)鍵。盡管核酸提取的方法已經(jīng)成熟，但科學(xué)界還是有一些新亮點(diǎn)。

手動(dòng)提取

手動(dòng)提取核酸的方法主要分為兩大類：液相提取和固相提取。盡管固相提取已經(jīng)成為主流，但基于酚/氯仿的液相提取方法仍被廣泛使用，也是當(dāng)前研究和改進(jìn)工作的主題。

2018年發(fā)表的論文《Optimization of phenol/chloroform RNA extraction》對(duì)經(jīng)典的1987配方進(jìn)行了改進(jìn)1。它通過(guò)增加一次氯仿洗滌、幾次RNA洗滌和兩次乙醇洗滌來(lái)減少終產(chǎn)物中的污染物。作者的結(jié)論是逆轉(zhuǎn)錄和RT-qPCR后的閾值更低，以及低豐度轉(zhuǎn)錄本的檢測(cè)靈敏度更高。

固相提取是基于核酸和硅膠柱之間的可逆交聯(lián)，或磁珠對(duì)目標(biāo)核酸的吸附。在這兩種情況下，提取過(guò)程都是在有利于結(jié)合的緩沖液中讓核酸與固相結(jié)合，然后洗掉污染物，再將分離出的核酸洗脫。磁珠法的優(yōu)勢(shì)在于不使用高速離心，因?yàn)檫@可能打斷大分子。

自動(dòng)提取

核酸提取的自動(dòng)化主要是用機(jī)器人系統(tǒng)來(lái)取代手動(dòng)處理，如緩沖液的交換、樣品管的移動(dòng)和微孔板的堆疊等。自動(dòng)化的優(yōu)勢(shì)在于操作過(guò)程保持一致，并且研究人員有時(shí)間去從事其他工作。核酸提取的自動(dòng)化系統(tǒng)也分為兩類：多用途的自動(dòng)化平臺(tái)和專門的核酸提取系統(tǒng)。

許多多功能平臺(tái)的制造商已經(jīng)開(kāi)發(fā)出控制軟件，能夠自動(dòng)化完成核酸提取試劑盒操作指南中的各個(gè)步驟。同時(shí)，這些靈活的系統(tǒng)還能夠?qū)⒑怂崽崛〔僮髋c下游應(yīng)用相整合。例如，Hudson Robotics的SOLO系統(tǒng)通過(guò)OD讀板器支持DNA的歸一化。它能夠與熱循環(huán)儀整合，完成PCR操作。此外，它還能將整個(gè)NGS文庫(kù)制備流程自動(dòng)化。

專門的核酸提取設(shè)備則占用較少的空間，專為幾種試劑盒而優(yōu)化。制造商不斷開(kāi)發(fā)出新的試劑盒和操作，以擴(kuò)展這些系統(tǒng)的功能。最近，Promega推出了Stabilized Saliva DNA試劑盒，可用于其Maxwell RSC系統(tǒng)。QIAGEN也推出了與QIAcube系統(tǒng)兼容的DNeasy PowerSoil Pro Kit。

特殊用途

通常，細(xì)胞采集和裂解之后會(huì)立即進(jìn)行上述的純化操作，以盡量避免因降解而造成的核酸產(chǎn)量或質(zhì)量下降。然而，FFPE（福爾馬林固定石蠟包埋）樣品和血液采集卡卻是兩個(gè)例外。

全世界的FFPE組織樣本庫(kù)代表了生物醫(yī)學(xué)研究的寶貴資源。不過(guò)，為保留樣本細(xì)節(jié)而設(shè)計(jì)的福爾馬林固定過(guò)程卻對(duì)核酸有害，而樣品脫蠟又讓核酸提取過(guò)程進(jìn)一步復(fù)雜化。近年來(lái)，各大廠商分別開(kāi)發(fā)出產(chǎn)品，旨在從FFPE樣本中高效提取出核酸。

不久前，挪威的研究人員對(duì)市場(chǎng)上七種FFPE核酸提取試劑盒進(jìn)行了比較，并在《Plos ONE》雜志上發(fā)表了結(jié)果2。他們認(rèn)為，盡管大多數(shù)的試劑盒都是基于離心柱方法，但脫蠟方法、捕獲表面和緩沖液組分存在明顯差異。他們還提供了有用的信息，可幫助研究人員選擇適合特定樣本和下游應(yīng)用的最佳方案。

血液采集卡采用普通濾紙經(jīng)特殊處理加工而成，用于生物分子的保存。保留在采集卡上的血斑具有很好的穩(wěn)定性，可以長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存，或在室溫環(huán)境下運(yùn)輸，直至提取過(guò)程開(kāi)始。

盡管血液采集卡已出現(xiàn)多年，但全球健康問(wèn)題再次推動(dòng)了產(chǎn)品研發(fā)。GenTegra公司的James Nelson博士認(rèn)為，主要的推動(dòng)因素是HIV和艾滋病。這家公司主要生產(chǎn)核酸等生物制品的室溫存儲(chǔ)產(chǎn)品。

人們往往采用定期的HIV RNA檢測(cè)來(lái)確定病毒數(shù)量，并監(jiān)控艾滋病的進(jìn)展。這些數(shù)據(jù)可用來(lái)評(píng)估治療方法是否成功?！懊磕暧?80萬(wàn)新的艾滋病病例，而70%的患者生活在非洲，在那里冷鏈運(yùn)輸是無(wú)法想象的，”Nelson博士解釋說(shuō)。

“在今年的研究中，我們發(fā)現(xiàn)我們的血液采集卡能夠從干血斑中釋放95%的核酸材料。傳統(tǒng)的濾紙型卡片丟失了一半左右。這種提取產(chǎn)量的差異提高了HIV監(jiān)控的效率，將對(duì)根除病毒產(chǎn)生重要的影響，”他說(shuō)。

全新方法

Purigen Biosystems正在開(kāi)發(fā)一種全新的方法。它利用等速電泳（ITP）的原理來(lái)分離細(xì)胞裂解液中的DNA，并將純化后的DNA濃縮成小體積。

與凝膠電泳技術(shù)不同，等速電泳是基于離子遷移率來(lái)分離和聚焦帶電分子，而非大小。在電場(chǎng)中，含有高遷移率離子的領(lǐng)先電解質(zhì)快速遷移，并與含有低遷移率離子的尾隨電解質(zhì)分離。在加入細(xì)胞裂解液后，它的DNA遷移速度介于兩者之間。經(jīng)過(guò)一段時(shí)間電泳后，達(dá)到完全分離。

“等速電泳是一種從細(xì)胞中提取和回收DNA的新方法，”Purigen Biosystems的Barney Saunders博士稱?！皞鹘y(tǒng)方法存在產(chǎn)量和純度變化、流程復(fù)雜、鹽和溶劑殘留等問(wèn)題。在等速電泳中，鹽濃度低得多，并且不需要溶劑或變性劑。沒(méi)有結(jié)合、洗滌或離心。”這家公司正計(jì)劃通過(guò)早期試用項(xiàng)目來(lái)檢驗(yàn)這項(xiàng)技術(shù)。