舊瓶裝新酒：核酸純化最近有哪些新亮點？

在臨床或科研實驗室中，各種各樣的樣本在等待著核酸提取，包括常規(guī)的血液和細胞，新鮮、冷凍或陳舊的組織活檢樣本，以及環(huán)境或農業(yè)應用中的土壤或植物樣本。提取是否成功，是決定下游實驗能否順利開展的關鍵。盡管核酸提取的方法已經(jīng)成熟，但科學界還是有一些新亮點。

手動提取

手動提取核酸的方法主要分為兩大類：液相提取和固相提取。盡管固相提取已經(jīng)成為主流，但基于酚/氯仿的液相提取方法仍被廣泛使用，也是當前研究和改進工作的主題。

2018年發(fā)表的論文《Optimization of phenol/chloroform RNA extraction》對經(jīng)典的1987配方進行了改進1。它通過增加一次氯仿洗滌、幾次RNA洗滌和兩次乙醇洗滌來減少終產(chǎn)物中的污染物。作者的結論是逆轉錄和RT-qPCR后的閾值更低，以及低豐度轉錄本的檢測靈敏度更高。

固相提取是基于核酸和硅膠柱之間的可逆交聯(lián)，或磁珠對目標核酸的吸附。在這兩種情況下，提取過程都是在有利于結合的緩沖液中讓核酸與固相結合，然后洗掉污染物，再將分離出的核酸洗脫。磁珠法的優(yōu)勢在于不使用高速離心，因為這可能打斷大分子。

自動提取

核酸提取的自動化主要是用機器人系統(tǒng)來取代手動處理，如緩沖液的交換、樣品管的移動和微孔板的堆疊等。自動化的優(yōu)勢在于操作過程保持一致，并且研究人員有時間去從事其他工作。核酸提取的自動化系統(tǒng)也分為兩類：多用途的自動化平臺和專門的核酸提取系統(tǒng)。

許多多功能平臺的制造商已經(jīng)開發(fā)出控制軟件，能夠自動化完成核酸提取試劑盒操作指南中的各個步驟。同時，這些靈活的系統(tǒng)還能夠將核酸提取操作與下游應用相整合。例如，Hudson Robotics的SOLO系統(tǒng)通過OD讀板器支持DNA的歸一化。它能夠與熱循環(huán)儀整合，完成PCR操作。此外，它還能將整個NGS文庫制備流程自動化。

專門的核酸提取設備則占用較少的空間，專為幾種試劑盒而優(yōu)化。制造商不斷開發(fā)出新的試劑盒和操作，以擴展這些系統(tǒng)的功能。最近，Promega推出了Stabilized Saliva DNA試劑盒，可用于其Maxwell RSC系統(tǒng)。QIAGEN也推出了與QIAcube系統(tǒng)兼容的DNeasy PowerSoil Pro Kit。

特殊用途

通常，細胞采集和裂解之后會立即進行上述的純化操作，以盡量避免因降解而造成的核酸產(chǎn)量或質量下降。然而，FFPE（福爾馬林固定石蠟包埋）樣品和血液采集卡卻是兩個例外。

全世界的FFPE組織樣本庫代表了生物醫(yī)學研究的寶貴資源。不過，為保留樣本細節(jié)而設計的福爾馬林固定過程卻對核酸有害，而樣品脫蠟又讓核酸提取過程進一步復雜化。近年來，各大廠商分別開發(fā)出產(chǎn)品，旨在從FFPE樣本中高效提取出核酸。

不久前，挪威的研究人員對市場上七種FFPE核酸提取試劑盒進行了比較，并在《Plos ONE》雜志上發(fā)表了結果2。他們認為，盡管大多數(shù)的試劑盒都是基于離心柱方法，但脫蠟方法、捕獲表面和緩沖液組分存在明顯差異。他們還提供了有用的信息，可幫助研究人員選擇適合特定樣本和下游應用的最佳方案。

血液采集卡采用普通濾紙經(jīng)特殊處理加工而成，用于生物分子的保存。保留在采集卡上的血斑具有很好的穩(wěn)定性，可以長時間儲存，或在室溫環(huán)境下運輸，直至提取過程開始。

盡管血液采集卡已出現(xiàn)多年，但全球健康問題再次推動了產(chǎn)品研發(fā)。GenTegra公司的James Nelson博士認為，主要的推動因素是HIV和艾滋病。這家公司主要生產(chǎn)核酸等生物制品的室溫存儲產(chǎn)品。

人們往往采用定期的HIV RNA檢測來確定病毒數(shù)量，并監(jiān)控艾滋病的進展。這些數(shù)據(jù)可用來評估治療方法是否成功?！懊磕暧?80萬新的艾滋病病例，而70%的患者生活在非洲，在那里冷鏈運輸是無法想象的，”Nelson博士解釋說。

“在今年的研究中，我們發(fā)現(xiàn)我們的血液采集卡能夠從干血斑中釋放95%的核酸材料。傳統(tǒng)的濾紙型卡片丟失了一半左右。這種提取產(chǎn)量的差異提高了HIV監(jiān)控的效率，將對根除病毒產(chǎn)生重要的影響，”他說。

全新方法

Purigen Biosystems正在開發(fā)一種全新的方法。它利用等速電泳（ITP）的原理來分離細胞裂解液中的DNA，并將純化后的DNA濃縮成小體積。

與凝膠電泳技術不同，等速電泳是基于離子遷移率來分離和聚焦帶電分子，而非大小。在電場中，含有高遷移率離子的領先電解質快速遷移，并與含有低遷移率離子的尾隨電解質分離。在加入細胞裂解液后，它的DNA遷移速度介于兩者之間。經(jīng)過一段時間電泳后，達到完全分離。

“等速電泳是一種從細胞中提取和回收DNA的新方法，”Purigen Biosystems的Barney Saunders博士稱?！皞鹘y(tǒng)方法存在產(chǎn)量和純度變化、流程復雜、鹽和溶劑殘留等問題。在等速電泳中，鹽濃度低得多，并且不需要溶劑或變性劑。沒有結合、洗滌或離心?！边@家公司正計劃通過早期試用項目來檢驗這項技術。