純干貨：IHC，WB 常見問題與結(jié)果解析

免疫組化結(jié)果常見問題分析

2. 抗原修復(fù)不全，換修復(fù)液或加強(qiáng)修復(fù)；

3. 組織切片本身這種抗原含量低，設(shè)陽性對(duì)照片；

4. 血清封閉時(shí)間過長；DAB 孵育時(shí)間過短；

6. 細(xì)胞通透不全，抗體未能充分進(jìn)入胞內(nèi)參與反應(yīng)。


(二)非特異性染色的原因（著色一片黃/背景深）

1. 抗體孵育時(shí)間過長，抗體濃度；

2. 多抗易出現(xiàn)非特異性，可選擇單抗；

3. 內(nèi)源性過氧化物酶和生物素滅活不夠；

4. 非特異性組分與抗體結(jié)合，延長血清封閉時(shí)間；

5. DAB 孵育時(shí)間過長或濃度過高；

6. PBS 沖洗不充分，殘留抗體結(jié)果增強(qiáng)著色；

7. 標(biāo)本染色過程中經(jīng)常出現(xiàn)干片；

8. 脫蠟不充分；

9. 二抗與標(biāo)本的內(nèi)源性組織蛋白有交叉反應(yīng)。


（三）染色弱陽性

1. 固定方式不當(dāng)或固定時(shí)溫度過高，影響到抗原的數(shù)量和質(zhì)量；

2. 不適當(dāng)?shù)目乖迯?fù)方式，抗原決定簇暴露不足；

3. 抗體的稀釋度是否過高或者孵育的溫度/時(shí)間不足；

4. 孵育抗體前切片上遺留了過多的沖洗液；

5. 孵育時(shí)切片未放置水平，導(dǎo)致抗體孵育不均勻。

1. 組織固定不及時(shí)，抗原擴(kuò)散移位；

2. 抗體選擇錯(cuò)誤；

3. 膜蛋白核質(zhì)染色：抗原修復(fù)過長，導(dǎo)致細(xì)胞膜破壞，膜蛋白轉(zhuǎn)移。

WB 結(jié)果常見問題分析

1. 無條帶：抗體用錯(cuò)，轉(zhuǎn)膜出錯(cuò)，抗原無表達(dá)，試劑失效等；

2. 細(xì)微弱帶：上樣量少，抗體濃度低，ECL 發(fā)光液失效等；

3. 高背景：封閉不夠，一抗?jié)舛雀?，洗膜不充分?/p>

4. 非特異性條帶：抗體特異性差，也可能樣品量大，抗體濃度高；

5. 條帶出現(xiàn)邊緣規(guī)則的白圈：轉(zhuǎn)膜時(shí)膜和膠之間有氣泡；

6. 條帶中間出現(xiàn)白色：高濃度 HRP 把底物消耗過快后不發(fā)光；

7. 膜上很多黑點(diǎn)：膜上雜質(zhì)與抗體非特異結(jié)合，洗膜充分，封閉液混勻；

8. 條帶拖尾：蛋白裂解不好，蛋白量大，抗體孵育時(shí)間長，濃度高等；

9. 出現(xiàn)非均一性背景：洗抗體和發(fā)光時(shí)膜出現(xiàn)風(fēng)干情況；

10. 條帶彎曲不平整：膠配置不均勻，膠中有氣泡雜質(zhì)，玻璃板沒洗干凈，電流不均一等；

11. 條帶蛋白分子量偏高/偏低：分離膠濃度選擇不恰當(dāng)，蛋白質(zhì)降解；

12. 所有條帶練成片：上樣量大或電泳中途停止過長，樣品彌散。