細(xì)胞凋亡 WB 沒成功，你是不是用了 RIPA？

樣品制備，看你是不是這樣做的：

自配裂解液或者購買 RIPA，加上樣品研磨啊研磨，孵育啊孵育，然后離心扔掉沉淀（RIPA 不可溶組分），取上清（RIPA 可溶組分）進(jìn)行下游實驗。

對對對！都是這么做啊，扔了取上清！

且慢，我們?nèi)拥袅?，扔掉了，扔掉了一些啥？要不要緊，影響細(xì)胞凋亡的實驗結(jié)果不？
 

例一 .SU YEON LEE，et al（2010）.Implication of necrosis-linked p53 aggregation in acquired apoptotic resistance to 5-FU in MCF-7 multicellular tumour spheroids. ONCOLOGY REPORTS 24: 73-79, 2010

研究方法

1. MCF-7 細(xì)胞培養(yǎng) 4-9 天后，用 RIPA 分別進(jìn)行蛋白提取，分為 RIPA 可溶性組分和不可溶性組分兩組

2. SDS-PAGE 后，立春紅染色（圖 A），用 WB 分別檢測 p53，CuZnSOD，MnSOD，Tubulin

主要發(fā)現(xiàn)

MTS 培養(yǎng)過程中，RIPA 不可溶性組分中蛋白增加，可溶性組分和不可溶性組分蛋白圖譜有很大差異，胞漿中的 CuZnSOD 和線粒體中的 MnSOD 只存在于 RIPA 可溶性組分中，而 p53 和 tubulin 則在 RIPA 可溶性和不可溶性組分中都存在。這表明，如果僅使用可溶性組分研究目標(biāo)蛋白的定量，則結(jié)論可能是不準(zhǔn)確或出現(xiàn)偏頗。

例二．CHO HEE KIM1 et al,(2010).Role of reactive oxygen species-dependent protein aggregation in metabolic stress-induced necrosis. INTERNATIONAL JOURNAL OF ONCOLOGY 37: 97-102,2010

研究方法

1. MDA-MB231 細(xì)胞，分別用 shCon，shSnail 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，分別培養(yǎng)于普通培養(yǎng)基及 GD 培養(yǎng)基 12 小時

2. 使用 RIPA 提取蛋白，分別將 RIPA 可溶性組分和 RIPA 不可溶性組分進(jìn)行 Snail, p53, pro-caspase 3, pro-caspase 9, and beclin 1，WB 檢測。

主要發(fā)現(xiàn)

某些特定刺激誘導(dǎo)凋亡后，P53，caspase3，caspase9 等會聚集在 RIPA 不可溶組分中，不可溶性組分中 P53 和 caspase 9 信號甚至比可溶性組分中更強(qiáng)，表明目標(biāo)蛋白在 RIPA 不可溶組分中顯著丟失。證明 RIPA 并不能提取到真正意義上的總蛋白，丟掉的不可溶組分中還有很多蛋白，甚至是目標(biāo)蛋白。

例三．Kevin A. Janes,(2016).An Analysis of Critical Factors for Quantitative Immunoblotting. Sci Signal. ; 8(371): rs2. doi:10.1126/scisignal.2005966.
研究方法

1. MCF10A-5E 人乳腺上皮細(xì)胞激活 Fas 死亡受體，無激活組為對照

2. 分別用 NP-40（不含 SDS 和脫氧膽酸鹽），RIPA buffer， Laemmil（SB）樣品緩沖液提取蛋白

3. WB 進(jìn)行 Clv-caspase-8 檢測, Hsp90,Tubulin，P38 作為對照
主要發(fā)現(xiàn)

結(jié)果顯示，僅在 Laemmil 緩沖液提取的樣品中檢測到激活形式的 Caspase-8，而使用 NP-40 和 RIPA 提取的蛋白樣品中均未檢測到。證明了 RIPA buffer 提取的蛋白并非是完整的蛋白譜，某些特定蛋白會因刺激方式在可溶性和不可溶性組分之間移動。

 

例四． Zapata et al., （1998）. Granzyme Release and Caspase Activation in Activated Human T-Lymphocytes. J Biol Chem 1998, 273:6916-6920.

Caspase 家族在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，其中 caspase-3 為關(guān)鍵的執(zhí)行分子，它在凋亡信號傳導(dǎo)的許多途徑中發(fā)揮功能。Caspase-3 正常以酶原（32KD）的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段，它被激活，活化的 Caspase-3 由兩個大亞基（17KD）和兩個小亞基（12KD）組成，裂解相應(yīng)的胞漿胞核底物，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。但在細(xì)胞凋亡的晚期和死亡細(xì)胞，caspase 的活性明顯下降。

研究方法

1. 分別使用 RIPA 和 2%SDS + 超聲提取未激活 T 淋巴細(xì)胞（Lanes 1 和 5）和激活的 T 淋巴細(xì)胞（Lanes 2-4 和 6-8）裂解細(xì)胞提取總蛋白

2. WB 進(jìn)行 caspase-3, caspase-7, parp and GD1 檢測

主要發(fā)現(xiàn)

p24, p20 存在于 RIPA 提取的蛋白中，但 Laemmli 裂解液提取的蛋白中卻不存在。證明了 RIPA buffer 提取蛋白時會人工激活 caspase-3 and caspase-7。用 Laemmli 緩沖液加超聲處理可進(jìn)一步從 RIPA 不可溶性組分中提取出蛋白。

這樣看了一圈下來，細(xì)胞凋亡 WB 沒成功的原因，很可能就是因為你用了 RIPA！那下面我們就詳細(xì)的看一下RIPA 不適合做細(xì)胞凋亡 WB 檢測的原因有哪些吧!

RIPA 不適合做細(xì)胞凋亡 WB 檢測的原因:

1. RIPA buffer 提取蛋白時會人工激活 caspase-3 and caspase-7。

2. RIPA buffer 提取的蛋白并非是完整的蛋白譜，目標(biāo)蛋白及內(nèi)參蛋白常常會丟失在被丟棄的不可溶組分中，僅使用可溶性組分研究不嚴(yán)謹(jǐn)。

3. RIPA buffer 提取的蛋白圖譜偏差會得出錯誤或偏差結(jié)論，特別是涉及目標(biāo)蛋白的定量問題時。

看了這些例證，是不是有點明白你凋亡研究 WB 為什么沒成功了？主要是你的蛋白樣品出現(xiàn)了問題，使用 RIPA不嚴(yán)謹(jǐn)，必須要解決蛋白丟失，溶解度差，得到真正意義上完整的蛋白圖譜。也許使用柱式法蛋白提取試劑盒，可以幫你解決蛋白丟失問題，得到完整的蛋白圖譜.