用于石蠟切片的骨相關(guān)酶（TRAP、ALP）的雙重染色法

1.  前言
了解活體的骨代謝狀態(tài)是研究相關(guān)細(xì)胞生理活性的一個(gè)有效方法。對骨組織進(jìn)行堿性磷酸酶（ALP）染色后可以了解成骨細(xì)胞的骨形成情況，對骨組織進(jìn)行抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色可以了解破骨細(xì)胞的骨吸收情況。若在同一切片上進(jìn)行雙重染色就能同時(shí)了解兩者的情況。另外，它有一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是在脫鈣標(biāo)本里，只要可以雙重染色，無需專用的設(shè)備，僅用一般的設(shè)備就可以方便地觀察到骨代謝。在此前提下，我們需要研究探討雙重染色的可行性。

實(shí)驗(yàn)材料及方法：
2.  標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)本的制作
用樹脂包埋法或凍結(jié)切片法制成的標(biāo)本作為標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)本，與脫鈣的石蠟切片作比較。也就是說，酒精固定小鼠肘關(guān)節(jié)后，用乙二醇甲基丙烯酸甲酯（GMA）包埋，使用硬組織用的切片機(jī)制作成2μｍ的切片，然后進(jìn)行TRAP與ALP染色（圖1）。繼而，制成脫鈣凍結(jié)切片（圖2）。之后，研究并改良在固定、脫鈣、染色各階段中雙重染色的可行性。
圖1. 標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)本（GMA樹脂包埋）

照片是小鼠的肘關(guān)節(jié)的染色標(biāo)本，作為本實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)本。左上圖是TRAP染色，右上圖是ALP染色。下圖是兩者的雙重染色。以此作為陽性對照，與脫鈣石蠟切片一起進(jìn)行染色及染色性的評價(jià)。
圖2. 脫鈣凍結(jié)切片的酶染色

用30%的庶糖液浸泡經(jīng)檸檬酸脫鈣的小鼠腰椎及右上肢，然后經(jīng)OCT復(fù)合物的包埋、Tissue-Tek PINO（Sakura Finetek Japan Co.,Ltd.產(chǎn)品）的凍結(jié)、Cryo 3（Sakura Finetek Japan Co.,Ltd.產(chǎn)品）的切割，得到5μｍ的凍結(jié)切片。切片進(jìn)行酶染色。不僅可以進(jìn)行TRAP染色（左圖：紅色）與ALP染色（中間：褐色）的單染色，還可以進(jìn)行雙重染色（右圖）。
 
圖3. 經(jīng)福爾馬林進(jìn)行第一次固定的固定時(shí)間及TRAP/ALP的

染色性研究
①是沒有經(jīng)過福爾馬林固定，只用酒精進(jìn)行第二次固定的樣品，ALP染色顯強(qiáng)陽性。TRAP染色顯陰性。②是經(jīng)福爾馬林16小時(shí)固定及③是4天固定后，TRAP與ALP都能很好地染色。然而，經(jīng)福爾馬林固定一個(gè)月后的臨床樣本（骨軟骨腫）雖然TRAP染色顯陽性，但ALP不能被染色。
 
圖4.  不同種類的脫鈣溶液對雙重染色的影響
最左圖是選用酸性脫鈣溶液中對組織傷害較少的甲酸福爾馬林

脫鈣溶液脫鈣3天（Histra-DC,8～16℃）后的大鼠膝關(guān)節(jié)。TRAP與ALP都不能被染色。與此相反，中間的檸檬酸鹽酸鹽脫鈣溶液及最右的EDTA脫鈣溶液都可以使樣品脫鈣后進(jìn)行TRAP/ALP雙重染色。

3.  關(guān)于固定
ALP染色使用不是由福爾馬林固定的新鮮材料，因此若不在短時(shí)間內(nèi)固定，就會失去其酶活性。我們建議使用80%的酒精去固定。請驗(yàn)證以下情況：

①    小鼠的膝關(guān)節(jié)不進(jìn)行第一次固定，直接用酒精浸泡進(jìn)行第二次固定組。
②    經(jīng)福爾馬林（4％多聚甲醛溶液）第一次固定小鼠腰椎16小時(shí)后，再用酒精進(jìn)行第二次固定組。
③    經(jīng)福爾馬林進(jìn)行第一次固定小鼠腰椎4天后，再進(jìn)行第二次固定組。
④    臨床的樣本經(jīng)福爾馬林進(jìn)行第一次固定小鼠腰椎一個(gè)月后，再進(jìn)行第二次固定組。

各組進(jìn)行TRAP、ALP的雙重染色,并檢驗(yàn)染色是否可行。圖3是染色的研究結(jié)果。在本實(shí)驗(yàn)中，福爾馬林固定時(shí)間為16小時(shí)至4天的可以進(jìn)行TRAP、ALP的雙重染色。

4.  關(guān)于脫鈣
ALP是含有金屬（Zn）的蛋白。脫鈣作用會使Zn也一并被除去而導(dǎo)致酶失去活性。為了彌補(bǔ)這個(gè)缺點(diǎn)，加入硫酸鋅（ZnSO4），使ALP活化。每100ml的脫鈣溶液加入0.4ml 1%的ZnSO4 溶液，以補(bǔ)充Zn。并且，在作為脫鈣溶液檸檬酸鹽酸鹽緩沖液中添加Zn的同時(shí)，加入相同量螯合劑EDTA溶液的相關(guān)研究在進(jìn)行中。也有研究在酸性脫鈣溶液（甲酸福爾馬林溶液）中的酶是否能反應(yīng)。結(jié)果顯示脫鈣溶液與檸檬酸一樣，在EDTA溶液中能很好地染色。相反，在甲酸福爾馬林溶液中不能使酶染色（圖4）。此外脫鈣方法是用超聲波脫鈣裝置（Histra-DC，普通光度）在8-16℃的低溫下，連續(xù)操作3-6天，使樣品脫鈣。脫鈣后用甘氨酸與佛羅那 （Veronal）緩沖液(pH7.4)洗凈，用磷酸鈣在組織上吸附，防止沉淀。

5.  關(guān)于染色
染色法使用的是Lorch的Gomori法。本實(shí)驗(yàn)使用的是同時(shí)采用偶氮染色法和偶聯(lián)反應(yīng)法的TRAP/ALP染色試劑盒（和光純藥，產(chǎn)品編號294-67001）。關(guān)于切片的厚度，Lorch建議為8μm，同時(shí)也研究過普通的4μm切片是否能染色、雙重染色的順序應(yīng)該先染TRAP和ALP中的哪一個(gè)、封片劑是否必須選水溶性封片劑等問題。

染色法的結(jié)果是偶氮染色法中，切片過厚就會有酶擴(kuò)散現(xiàn)象，即骨基質(zhì)的TRAP染色傾向染成紅色。即使是4μm的切片，只要增強(qiáng)了反應(yīng)條件（反應(yīng)溫度及反應(yīng)時(shí)間），也能充分染色。也就是說，TRAP染色反應(yīng)溫度為室溫至37℃，反應(yīng)時(shí)間為30分鐘至45或60分鐘。ALP染色可在37℃下反應(yīng)45分鐘至3小時(shí)，也可在室溫（10~15℃）下延長反應(yīng)時(shí)間至一晚。最后，可以得到兩者色調(diào)平衡、良好的染色結(jié)果（圖5）。但是，增強(qiáng)反應(yīng)條件會使ALP染色的切片上產(chǎn)生更多的色素顆粒（圖2）。而TRAP與ALP的染色順序從任意一方開始都可以。但是，先ALP再TRAP染色時(shí)，陽性部位呈現(xiàn)明顯紅色，使用新鮮的破骨細(xì)胞染色，能得到相對好的標(biāo)本。但是ALP的反應(yīng)原產(chǎn)物因TRAP溶液而產(chǎn)生白色混濁顆粒狀體，會在組織上沉淀。因此，先TRAP染色再ALP染色的話會比較好。封片：用甲基綠，幾秒即可使核染色，水洗后在37℃下干燥，經(jīng)二甲苯透明，經(jīng)屈大麻酚(Marinol)永久封片。有文獻(xiàn)建議在透明前使用酒精脫水，但這會使反應(yīng)產(chǎn)物浸出及擴(kuò)散。
圖5. 脫鈣石蠟包埋切片的TRAP/ALP雙重染色
使用1歲小鼠腰椎的EDTA脫鈣石蠟切片進(jìn)行TRAP/ALP雙重染色。破骨細(xì)胞的TRAP染色呈紅色，細(xì)胞活性強(qiáng)的細(xì)胞（成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞）ALP染色為褐色。（上面：弱擴(kuò)大，下面：強(qiáng)擴(kuò)大）

6.  結(jié)語
TRAP與ALP兩種酶在每次固定、脫鈣、染色后，只要經(jīng)過若干改良，就可以使脫鈣后的石蠟標(biāo)本染色。但是，酶擴(kuò)散現(xiàn)象，特別是在TRAP染色時(shí)這種現(xiàn)象更明顯。影響因素有多種，主要應(yīng)該是受固定的影響，若固定不充分，脫鈣時(shí)很容易出現(xiàn)問題，從而導(dǎo)致酶擴(kuò)散現(xiàn)象的發(fā)生。此外必須注意脫鈣自身的影響，也就是說，與非脫鈣標(biāo)本相比，脫鈣標(biāo)本觀察到的擴(kuò)散現(xiàn)象較多。說明標(biāo)本脫鈣很可能導(dǎo)致酶擴(kuò)散。另外，也應(yīng)考慮切片的厚度或雙重染色的順序影響。今后我們將向這個(gè)方向研究。