單細胞懸液的制備方法

  機械性或人工制備的單細胞，在某些性質(zhì)上很可能已改變了原組織細胞特性，因此處理不同組織時，努力摸索方法，盡可能采用對細胞損傷小，產(chǎn)率較高的單細胞懸液制備方法，最大限度地保持細胞原有特性。遠慕生物為您介紹幾種細胞懸液制備方法，僅供參考。 （一）酶消化法
  酶的作用原理主要有三方面：一是破壞組織間的膠原纖維、彈性纖維等，二是水解組織細胞的緊密連接結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，三是水解組織粘多糖物質(zhì)。
酶消化法是實體組織分散為單細胞的主要方法之一。常用的酶類有：胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、鏈霉蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、溶菌酶、彈性蛋白酶等?？筛鶕?jù)分散的組織類型確定使用的酶類。需要注意的是使用條件和影響因素（酶濃度、酶效價、作用時間、pH值）等，如胃蛋白酶在堿性環(huán)境下失去活性，胰酶在中性溶液中活性欠佳。

酶消化法常規(guī)程序如下：
1、將適合于酶消化的組織置于離心管中。
2、將選好的酶溶液1～2ml加入盛有被消化組織的試管中。
3、常規(guī)消化20～30min（恒溫37℃或室溫），消化期間間斷振蕩或吹打。
4、終止消化，收集細胞懸液，以300目尼龍網(wǎng)過濾，除去細胞，以低速離心除去細胞碎片。
5、加入PBS 2ml充分混勻，離心棄掉上清。再加入0.5ml PBS重懸細胞。
6、將制備好的單細胞懸液進行熒光標記后上機檢測或保存?zhèn)溆谩?br> （二）機械法
  機械法分散實體組織包括：用剪刀剪碎組織或用鋒利的解剖刀剁碎組織，用勻漿器勻漿，用線注射針頭反復抽吸細胞等，最后用300目尼龍網(wǎng)過濾細胞得到單細胞懸液。
1、剪碎法 （1）將組織塊放入平皿中，加入少量生理鹽水。
（2）用剪刀將組織剪至勻漿狀。
（3）加入10ml生理鹽水。
（4）用吸管吸取組織勻漿，先以100目尼龍網(wǎng)過濾到試管內(nèi)。
（5）離心沉淀1000rpm/min，4～5min，再用生理鹽水洗3次，每次以短時低速（500～800rpm/min）離心沉淀去除細胞碎片。
（6）以300目尼龍網(wǎng)過濾去除細胞。
（7）選擇適當?shù)墓潭ㄒ海?0％冰乙醇等）固定細胞或低溫保存?zhèn)溆谩?br> 2、網(wǎng)搓法
（1）將100目、300目尼龍網(wǎng)扎在小燒杯上。
（2）把剪碎的組織放在網(wǎng)上，用眼科鑷子輕輕搓組織塊，邊搓邊用生理鹽水沖洗，直到將組織搓完。
（3）收集細胞懸液，離心沉淀細胞500～800rpm/min，2分鐘。
（4）固定細胞或低溫保存?zhèn)溆谩?br> 3、研磨法
（1）先將組織剪碎成1～2mm3小塊。
（2）放入組織研磨器中加入1～2ml生理鹽水。
（3）轉(zhuǎn)動研棒，研至勻漿。
（4）加入10ml生理鹽水，沖洗研磨器。
（5）收集細胞懸液，并經(jīng)300目尼龍網(wǎng)過濾，離心沉淀細胞，500～800rpm/min，2分鐘，再用生理鹽水洗3遍，離心沉淀。
（6）固定或低溫保存細胞，備用。
（三）化學處理法
  化學處理法的主要原理是：將組織細胞間起粘連作用的鈣、鎂離子置換出來，從而使細胞分散下來。
1、試劑配制
（1）0.2％EDTA配制：將0.2gEDTA溶解于100ml Hank液中，封裝高壓消毒，置0～4℃保存。
（2）胰酶加EDTA配制：胰酶0.25g加PBS（pH7.0）200ml，濃度為0.125％，EDTA0.2g加PBS（pH7.0）100ml，濃度為0.2％。各取40ml混合，分裝后置0～4℃冰箱保存，使用前過濾即可使用。
2、實驗方法
（1）將組織切成薄片，置于試管。
（2）首先加入EDTA液5ml，室溫下0.5小時，離心棄之。
（3）加入胰酶－EDTA液5～10ml，置37℃恒溫水浴30min，間斷振蕩3～5次。
（4）用300目尼龍網(wǎng)過濾，離心沉淀1000rpm/min，5分鐘。再以生理鹽水洗2～3次，離心500～800rpm，1～2分鐘。
（5）將細胞固定或低溫保存?zhèn)溆谩?br> 化學處理法獲得的細胞存活率低，細胞產(chǎn)量較低，細胞碎片和細胞聚集量不穩(wěn)定。