葡聚糖凝膠操作步驟及注意事項(xiàng)

2018-02-26 17:24 來源：上海遠(yuǎn)慕生物試劑

摘要：葡聚糖凝膠(Sephadex)是白色珠狀顆粒，由葡聚糖經(jīng)醚鍵相互交聯(lián)聚合而成具有多孔性三度空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高分子分離材料，為穩(wěn)定的親水性凝膠，在水中和電解質(zhì)中很容易溶脹。

葡聚糖凝膠指的是由一定平均相對分子質(zhì)量的葡聚糖(dextran) 和甘油基以醚橋形式相互交聯(lián)而成，具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，應(yīng)用面廣的一類凝膠，國外商品名為Sephadex。

葡聚糖凝膠操作步驟：
1、乙醇浸泡：在室溫下，將干粉浸泡于50-60%乙醇中至少24小時，并不斷攪拌以保證凝膠溶脹，用無鹽水洗去殘存的乙醇濾干。
2、無鹽水浸泡：室溫下，在無鹽水中充分溶脹24小時，間隙攪拌，以保證凝膠的完全溶脹。
3、鹽酸浸泡：在常溫下再用0.1MHCl浸泡12小時，間隙攪拌，濾干，水洗只中性。
4、裝柱：層析柱的選擇一般根據(jù)分離樣品的種類和樣品的數(shù)量而定。純化蛋白質(zhì)時，柱床體積應(yīng)為樣品體積的25～100倍。去除鹽及游離熒光素約為樣品體積的4～10倍。柱太短，影響分離效果。柱長一些，分離效果好，但柱太長，則延長分離時間，樣品也稀釋過度。層析柱的內(nèi)徑也要選擇適當(dāng)。內(nèi)徑過細(xì)，會發(fā)生“器壁效應(yīng)”，即靠近管壁的流速要大于中心的流速影響分離效果。所以層析柱的內(nèi)徑和高度應(yīng)有一定的比例。對于除鹽來說應(yīng)為1︰5～1︰25;對于純化蛋白質(zhì)來說應(yīng)為1︰20～1︰100。凝膠柱的裝填方法和要求，基本上與離子交換柱的制備相同。一根理想的凝膠柱要求柱中的填料(凝膠)密度均勻一致，沒有空隙和氣泡。通常新裝的凝膠柱用適當(dāng)?shù)木彌_溶液平衡后，將帶色的蘭葡聚糖–2000、細(xì)胞色素，或血紅蛋白等物質(zhì)配制成質(zhì)量濃度為2g/L的溶液過柱，觀察色帶是否均勻下移，以鑒定新裝柱的技術(shù)質(zhì)量是否合格，否則，必須重新裝填。
5、平衡：上樣前平衡層析柱至少3-5個柱體積直到記錄儀基線變得平穩(wěn)為止(流出液的PH值等于上柱的Buffer的PH值)。
6、上樣：凝膠過濾的上樣量一般為5%的柱床體積，我們建議初次上樣控制在1-2%的床體積，視分離情況可以調(diào)整;脫鹽時上樣量可以達(dá)到20%的柱床體積，柱高的選擇也與分離要求相關(guān)，柱高控制在40-50cm以下，過高的凝膠層會引起較大的反壓，應(yīng)當(dāng)盡可能避免。難分離物質(zhì)要有一定柱高和流速控制，脫鹽時高徑比為5：1即可。
7、洗脫方法：可以用無鹽水，也可以采用上柱時的緩沖液洗脫;在上柱Buffer中加入NaCl等梯度洗脫或鹽梯度洗脫也可以完全分離純化。
8、清洗：每次用完之后，將柱子里的緩沖液置換為去離子水，然后用20%的乙醇封存。
9、在位清洗(CIP)：凝膠使用十次后作一次CIP，目的是去除柱床內(nèi)沉淀的及頑固殘留的蛋白。方法是以40cm/h用0.1M氫氧化鈉反向洗四個柱體積，再以至少三個柱體積平衡緩沖液再生。
10、保存：凝膠使用完后，可將其回收，可將凝膠用超純水沖洗干凈并濾干，加入0.02%的疊氮鈉做為防腐劑，或者浸泡在20%的乙醇中，防止長菌。

葡聚糖凝膠注意事項(xiàng)：
凝膠柱層析一般都以單一緩沖溶液或鹽溶液作為洗脫液，有時甚至可用蒸餾水；洗脫時用于流速控制的裝置最好的是恒流泵；若無此裝置，可用控制操作壓的辦法進(jìn)行；樣品體積不宜過多，最好為床體積的1%～5%，最多不要超過10%；樣品濃度也不宜過大，濃度過大粘度大，分離效果差，一般不超過4%。

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