蘇木素-伊紅染色法檢測細胞凋亡實驗步驟

蘇木素-伊紅（hematoxylin/eosin）染色法是一種用普通光學顯微鏡觀察凋亡細胞形態(tài)學特征的簡便方法。細胞凋亡時主要的形態(tài)學變化為細胞體積變小，胞質(zhì)濃縮，染色質(zhì)高度凝集、邊緣化，呈新月狀，隨后染色質(zhì)裂解成大小不等的塊狀，核膜裂解，細胞以類似胞吐的方式形成凋亡小體。蘇木素容易被氧化，其氧化產(chǎn)物蘇木紅是真正的染料，蘇木紅與鋁結(jié)合形成一種帶正電荷的藍色色精，呈堿性。帶負電荷的脫氧核糖核酸根和帶正電荷的藍色色精進行極性吸附而完成細胞核的染色。伊紅可分為幾種，如伊紅Y和伊紅B等。伊紅Y是一種酸性紅色胞質(zhì)性染料，對細胞質(zhì)、肌纖維及膠原纖維具有著色性，呈粉紅色。細胞經(jīng)HE染色后，細胞核呈藍紫色，細胞質(zhì)呈粉紅色，根據(jù)凋亡細胞的形態(tài)學特征可觀察細胞凋亡的情況。


貼壁細胞的H/E染色

1）對于貼壁生長的細胞，讓其在蓋玻片上爬行生長。

2）經(jīng)藥物或其他因素處理誘導細胞凋亡后，取出蓋玻片，用×1 PBS輕輕洗滌，室溫，3分鐘×3次。

3）用4%的多聚甲醛在常溫下固定20分鐘或冷丙酮-20℃固定15分鐘，取出細胞爬片，室溫晾干，-20℃保存或直接進行染色。

4）蒸餾水浸泡細胞爬片5分鐘。

5）放入蘇木精液染5~7分鐘。

6）流水洗去附著染液，1%鹽酸酒精分化1~2秒。

7）流水沖洗10分鐘藍化，使切片由淡紅色變?yōu)榛宜{色。

8）放入伊紅染液中2~5秒。

9）放入95%酒精Ⅰ（2分鐘）→95%酒精Ⅱ（2分鐘）→100%酒精I（2分鐘）→100%酒精I（5分鐘）→二甲苯Ⅰ（2分鐘）→二甲苯Ⅱ（2分鐘）中脫水、透明。

10）中性樹膠封片。

11）在普通光學顯微鏡下觀察凋亡細胞形態(tài)。


懸浮細胞的H/E染色

1）對于懸浮生長的細胞經(jīng)藥物或其他因素處理誘導細胞凋亡后，置入離心管中，離心（1000rpm，5分鐘），收集細胞。

2）×1 PBS洗滌細胞1~2次。

3）調(diào)整細胞數(shù)為（1~15）×104/ml，涂片或用離心甩片，4%的多聚甲醛在常溫下固定20分鐘或冷丙酮-20℃固定15分鐘，取出細胞爬片，室溫晾干，-20℃保存或直接進行染色。

4）蒸餾水浸泡細胞爬片5分鐘。

5）接貼壁細胞H/E染色步驟中的5）-11）。


注意事項

①細胞核染色淡，原因可能為蘇木素染色時間過短、染液過度氧化失去染色能力或者分化步驟時間過長等；而細胞核染色過深的原因可能為蘇木素染色時間過長或者分化時間太短。

②細胞核如果呈紅或棕色，原因可能為蘇木素染液過度氧化或蘇木素染色后水中返藍不足，可用流水或弱堿性溶液如稀氨水或0.2%NaHCO3，在蘇木精染色后給細胞足夠的藍化時間。

③當室溫低，不利于染色時，通?？捎眉訜崛疽旱姆椒ㄟM行染色。