【PCR檢測】病原微生物檢測操作方法

多聚酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)是一種模擬天然DNA復制過程，在體外擴增特異性DNA（或RNA）片段的新技術。本實驗是將待檢雙鏈DNA經94℃高溫變性成單鏈作模板，然后加入一對人工合成的寡核苷酸引物，引物分別與待擴增DNA片段的兩端互補，經55℃低溫退火，引物與模板互補結合。在72℃條件下，結合于模板上的引物在DNA聚合酶的催化下，利用反應體系中的4種dNTP為原料，按堿基互補配對的方式延伸合成兩條新的DNA鏈。經過20-30個周期后，特異的目的DNA可擴增百萬倍以上。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳后即可觀察到特異的擴增條帶。

PCR方法操作簡便，靈敏度高，可檢測出少至0.1pg的目的DNA。目前已廣泛應用于多種病原微生物及寄生蟲的檢測。

【材料】

1．無菌雙蒸水、石蠟油、溴化乙錠

2．10×PCR反應緩沖液

3．25mmol dNTP混合液

4．引物1，引物2各50pmol／u1

5．模板DNA

6．5U／ul Taq DNA聚合酶

【儀器】

1．PCR擴增儀

2．電泳儀

3．紫外線分析儀

【方法】

1．在0.5m1EP管中，加入以下成分：

10×PCR反應緩沖液5u1

引物1 2ul

引物1 2ul

模板DNA 10u1

dNTP混合液4ul

Taq DNA聚合酶1ul

無菌雙蒸水加至50ul

混勻,加50 ul石蠟油，防止樣品水分蒸發(fā)。

2．將反應管置于PCR儀中，94℃變性4min。然后按94℃變性30s→55℃退火30s→72℃延伸1min，循環(huán)35次后，72℃延伸10 min。

3．反應完成后，取l0ul PCR擴增液，加至2％瓊脂糖凝膠中進行電泳，電壓100V，電泳30~60min后，置紫外線分析儀下觀查擴增結果。