使用多聚甲醛固定細胞爬片、甩片或切片的方法

當(dāng)純凈甲醛在水溶液中溶解時，會自動聚合成長鏈的多聚甲醛。其長度不一，在水中同時進行聚合與解聚反應(yīng)。甲醛易溶于脂類物質(zhì)，因此能穿過細胞膜進入細胞內(nèi)。用多聚甲醛固定細胞時，能使細胞內(nèi)的自由氨基基團發(fā)生化學(xué)交聯(lián)。當(dāng)不同的分子發(fā)生交聯(lián)時，形成一網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，把細胞的各個結(jié)構(gòu)成分連接起來。

單獨用多聚甲醛固定細胞不能使抗體進入細胞內(nèi)，在檢測細胞內(nèi)抗原時，標(biāo)本經(jīng)多聚甲醛固定后必須用非離子去污劑透化標(biāo)本。

不主張使用商業(yè)甲醛溶液作為細胞染色的固定液，因為商業(yè)甲醛實際上是甲醛和甲醇（乙醇）的混合物，甲醇和乙醇的作用是防止甲醛分子聚合，使其保持單體狀態(tài)。使用商業(yè)甲醛處理細胞有兩個缺陷：不具有多聚甲醛固定細胞的優(yōu)點；細胞卻被甲醇固定。
 
多聚甲醛固定方法為：

①用PBS洗滌玻片或培養(yǎng)皿；如果是單個的載玻片或蓋玻片，用鑷子鑷取，放入裝有PBS的燒杯中。如果載玻片或蓋玻片的數(shù)量較多，將其放在專用的支架上。如果是培養(yǎng)皿，將PBS倒入其中洗滌；

②倒掉PBS，但勿使標(biāo)本干燥；

③加入4%多聚甲醛(臨用前配制)，室溫下靜置10min；

④用PBS洗滌細胞兩次；

⑤用含0.2%TritonX-100或NP-40的PBS溶液透化固定后的細胞2min（室溫），有些標(biāo)本可能需要長達15min，時間視抗原而定；

⑥PBS洗滌細胞4次，洗滌時間不少于5min。此時，可加入抗體。

常見問題 ：

用交聯(lián)劑如多聚甲醛固定蛋白質(zhì)比用有機溶劑能更好地保持細胞結(jié)構(gòu)，但可能降低某些細胞組分的抗原性。經(jīng)多聚甲醛固定后，與胞內(nèi)自由氨基結(jié)合的抗體也許不再識別這些抗原。如果抗體在其他實驗中效果良好，但在經(jīng)多聚甲醛固定的標(biāo)本中不能有效地作用，可以嘗試逐步降低多聚甲醛的濃度。這樣雖然使細胞內(nèi)各成分的交聯(lián)程度降低，但有利于細胞結(jié)構(gòu)的保持，可以使抗體更好地與抗原中的某些結(jié)合部位接觸。

注意事項：

①多聚甲醛的固定是不穩(wěn)定的，標(biāo)本經(jīng)多聚甲醛固定后應(yīng)再經(jīng)去污劑處理，如果標(biāo)本在水溶液中浸泡的時間過長，則會使交聯(lián)結(jié)構(gòu)解體。因此，應(yīng)避免固定后的標(biāo)本在水溶液中浸泡的時間過長；

②若用多聚甲醛固定懸浮細胞，因為細胞呈懸浮狀態(tài)，洗滌過程復(fù)雜，因此，應(yīng)注意離心時間不要過長或轉(zhuǎn)速太高。一般用200×g離心5min。

在免疫染色實驗中，如果可用的抗體使用效果均不佳，有三種方法可以使之改善。

首先建議試用上述兩種固定方法，因為這兩種方法的固定機制存在很大區(qū)別?？贵w在一種固定方法中檢測效果不理想，有可能在另一種固定方法中工作良好。第二個解決問題的方法是降低固定液的濃度，用系列稀釋的固定液進行試驗。下面選擇的方法雖然簡單，但在非常低濃度固定液的情況下，仍能達到良好的固定效果。第三種方法是根據(jù)固定方法來制備抗體，先將抗原用固定液固定后，再去免疫動物產(chǎn)生抗體。在這種情況下，所用抗原將和實驗中固定后的抗原非常相似，能夠獲得結(jié)合固定抗原的抗體。