人抗心肌抗體(AMA)Elisa試劑盒操作步驟

人抗心肌抗體(AMA)Elisa試劑盒實驗原理
本試劑盒應用雙抗體夾心法測定樣品指標水平。樣品包括血清血漿尿液腦脊液細胞固體組織等，用純化的抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入樣品，再與HRP標記的抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品濃度呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標準曲線計算樣品中濃度，或者與CUTOFF值相比較，從而判定標本陰陽性。

人抗心肌抗體(AMA)Elisa試劑盒組成
1 30倍濃縮洗滌液      20ml×1瓶
2 酶標試劑                 6ml×1瓶
3 酶標包被板              12孔×8條
4 樣品稀釋液              6ml×1瓶
5 顯色劑A液               6ml×1瓶   
6 顯色劑B液               6ml×1/瓶  
7 終止液                     6ml×1瓶
8 標準品                     0.5ml×1瓶
9 標準品稀釋液           1.5ml×1瓶
10 封板膜                   2張

樣品收集、處理及保存方法
1.  血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過程中避免任何細胞刺激，收集血液后，3000轉(zhuǎn)      離心10分鐘將血清和紅細胞迅速          小心地分離。
2.  血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000轉(zhuǎn)離心30分鐘取上清。
3.  細胞上清液：3000轉(zhuǎn)離心10分鐘去除顆粒和聚合物。
4.  組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000轉(zhuǎn)離心10分鐘取上清。
5.  保存：如果樣本收集后不及時檢測，請按一次用量分裝，凍存于-20℃，避免反復凍融，在         室溫下解凍并確保樣品均勻地充  分解凍。

樣本要求
1．樣本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融
2．不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。

人抗心肌抗體(AMA)Elisa試劑盒操作步驟
1.標準品的稀釋：本試劑盒提供原倍標準品一支，用戶可按照隨貨說明書中圖表在小試管中進行稀釋。
2.加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、標準孔、待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣50μl，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品最終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。
3.溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。   
4.配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用
5.洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。
6.加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。
7.溫育：操作同3。
8.洗滌：操作同5。
9.顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10分鐘.
10.終止：每孔加終止液50μl，終止反應（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。
11.測定：以空白孔調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行。

計算
以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。

人抗心肌抗體(AMA)Elisa試劑盒注意事項
1．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未用完，板條應裝入密封袋中保存。
2．濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結(jié)果。
3．各步加樣均應使用加樣器，并經(jīng)常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間最好控制在5分鐘內(nèi)，如標本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。
4．請每次測定的同時做標準曲線，最好做復孔。如標本中待測物質(zhì)含量過高（樣本OD值大于標準品孔第一孔的OD值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n倍）后再測定，計算時請最后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）。
5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6．底物請避光保存。
7．嚴格按照說明書的操作進行，試驗結(jié)果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準.
8．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。
9．本試劑不同批號組分不得混用。
10．保存2-8℃。
11．有效期：6個月