人肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白B(SP-B)ELISA試劑盒使用說明書

人肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白B （SP-B ）酶聯(lián)免疫分析（ ELISA ）試劑盒使用說明書

本試劑僅供研究使用 目的：本試劑盒用于測定人血清，血漿及相關(guān)液體樣本中肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白B （SP-B ）的 含量。

實驗原理：
本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標(biāo)本中人肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白 B （ SP-B ）水平。用純化的人肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白 B （ SP-B ）抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白 B （ SP-B ）再與 HRP 標(biāo)記的 SP-B 抗體結(jié)合，形成抗體 - 抗原 - 酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物 TMB 顯色。 TMB 在 HRP 酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白 B （ SP-B ）呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在 450nm 波長下測定吸光度（ OD 值），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中人肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白 B （ SP-B ）濃度。

試劑盒組成 ：
試劑盒組成     48 孔配置     96 孔配置     保存
說明書     1 份     1 份     
封板膜     2 片（ 48 ）     2 片（ 96 ）     
密封袋     1 個     1 個     
酶標(biāo)包被板     1 × 48     1 × 96     2-8 ℃保存
標(biāo)準(zhǔn)品： 54ng/L     0.5ml × 1 瓶     0.5ml × 1 瓶     2-8 ℃保存
標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液     1.5ml × 1 瓶     1.5ml × 1 瓶     2-8 ℃保存
酶標(biāo)試劑     3 ml × 1 瓶     6 ml × 1 瓶     2-8 ℃保存
樣品稀釋液     3 ml × 1 瓶     6 ml × 1 瓶     2-8 ℃保存
顯色劑 A 液     3 ml × 1 瓶     6 ml × 1 瓶     2-8 ℃保存
顯色劑 B 液     3 ml × 1 瓶     6 ml × 1 瓶     2-8 ℃保存
終止液     3ml × 1 瓶     6ml × 1 瓶     2-8 ℃保存
濃縮洗滌液     （ 20ml × 20 倍）× 1 瓶     （ 20ml × 30 倍）× 1 瓶     2-8 ℃保存

樣本處理及要求 ：
1. 血清：室溫血液自然凝固 10-20 分鐘，離心 20 分鐘左右（ 2000-3000 轉(zhuǎn) / 分）。仔細(xì)收集上清，保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。
2. 血漿：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇 EDTA 或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合 10-20 分鐘后，離心 20 分鐘左右（ 2000-3000 轉(zhuǎn) / 分）。仔細(xì)收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)該再次離心。
3. 尿液：用無菌管收集，離心 20 分鐘左右（ 2000-3000 轉(zhuǎn) / 分）。仔細(xì)收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。
4. 細(xì)胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心 20 分鐘左右（ 2000-3000 轉(zhuǎn) / 分）。仔細(xì)收集上清。檢測細(xì)胞內(nèi)的成份時，用 PBS （ PH7.2-7.4 ）稀釋細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度達(dá)到 100 萬 /ml 左右。通過反復(fù)凍融，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。離心 20 分鐘左右（ 2000-3000 轉(zhuǎn) / 分）。仔細(xì)收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。
5. 組織標(biāo)本：切割標(biāo)本后，稱取重量。加入一定量的 PBS ， PH7.4 。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。?biāo)本融化后仍然保持 2-8 ℃的溫度。加入一定量的 PBS （ PH7.4 ），用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分。離心 20 分鐘左右（ 2000-3000 轉(zhuǎn) / 分）。仔細(xì)收集上清。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。
6. 標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實驗。若不能馬上進(jìn)行試驗，可 將標(biāo)本放于 -20 ℃保存，但 應(yīng)避免反復(fù)凍融
7. 不能檢測含NaN3的樣品 ，因 NaN3 抑制辣根過氧化物酶的（ HRP ）活性。

操作步驟
1. 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣：在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔 10 孔，在第一、第二孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品 100μl ，然后在第一、第二孔中加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 50μl ，混勻；然后從第一孔、第二孔中各取 100μl 分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 50μl ，混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取 50μl 棄掉，再各取 50μl 分別加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 50ul ，混勻；混勻后從第五、第六孔中各取 50μl 分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 50μl ，混勻后從第七、第八孔中分別取 50μl 加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 50μl ，混勻后從第九第十孔中各取 50μl 棄掉。（稀釋后各孔加樣量都為 50μl ，濃度分別為 36 ng/L ， 24 ng/L ， 12n g/L ， 6 ng/L ， 3 ng/L ）。
2. 加樣：分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、 待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液 40 μ l ，然后再加待測樣品 10 μ l （樣品最終稀釋度為 5 倍）。 加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。
3. 溫育：用封板膜封板后置 37 ℃溫育3 0 分鐘。
4. 配液：將 30 （ 48T 的 20 倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水 30 （ 48T 的 20 倍）倍稀釋后備用。
5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置 30 秒后棄去，如此重復(fù) 5 次，拍干。
6. 加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑 50μl ，空白孔除外。
7. 溫育：操作同 3 。
8. 洗滌：操作同 5 。
9. 顯色：每孔先加入顯色劑 A50μl ，再加入顯色劑 B50μl ，輕輕震蕩混勻， 37 ℃避光顯色15 分鐘.
10. 終止：每孔加終止液 50μl ，終止反應(yīng)（此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。
11. 測定：以空白空調(diào)零， 450nm 波長依序測量各孔的吸光度（ OD 值）。 測定應(yīng)在加終止液后 15 分鐘以內(nèi)進(jìn)行。

注意事項：
1． 試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡 15-30 分鐘后方可使用，酶標(biāo)包被板開封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。
2． 濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結(jié)果。
3． 各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對其準(zhǔn)確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間最好控制在 5 分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。
4． 請每次測定的同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線，最好做復(fù)孔。如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高（樣本 OD 值大于標(biāo)準(zhǔn)品孔第一孔的 OD 值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（ n 倍）后再測定，計算時請最后乘以總稀釋倍數(shù)（ ×n ×5 ）。
5． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6． 底物請避光保存。
7． 嚴(yán)格按照說明書的操作進(jìn)行，試驗結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn) .
8． 所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。
9． 本試劑不同批號組分不得混用。
10. 如與英文說明書有異，以英文說明書為準(zhǔn)。
 
計算：
以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)， OD 值為縱坐標(biāo)， 在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的 OD 值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋 倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與 OD 值計算出標(biāo) 準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的 OD 值 代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋 倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。
 
試劑盒性能：
1. 樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù) R 值為 0.92 以上。
2. 批內(nèi)與批見應(yīng)分別小于 9% 和 15%
保存條件及有效期：
1. 試劑盒保存： ； 2-8 ℃ 。
2 ．有效期： 6 個月


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