人抗呼吸道合胞病毒抗體(RSV)ELISA試劑盒使用說明書

人抗呼吸道合胞病毒抗體(RSV)酶聯(lián)免疫分析（ELISA）試劑盒使用說明書

本試劑僅供研究使用目的：本試劑盒用于檢測人血清，血漿及相關液體樣本中抗呼吸道合胞病毒抗體(RSV)水平，感染人的血液學診斷。

實驗原理：
本試劑盒采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法（ELISA）測定標本中人抗呼吸道合胞病毒抗體(RSV)。用純化的抗體包被微孔板，制成固相抗體，可與樣品中抗呼吸道合胞病毒抗體(RSV)相結(jié)合，經(jīng)洗滌除去未結(jié)合的抗體和其他成分后再與HRP標記的抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），與CUTOFF值相比較，從而判定標本中人抗呼吸道合胞病毒抗體(RSV)的存在與否。

試劑盒組成：
試劑盒組成    48孔配置    96孔配置    保存
說明書    1份    1份    
封板膜    2片（48）    2片（96）    
密封袋    1個    1個    
酶標包被板    1×48    1×96    2-8℃保存
陰性對照    0.5ml×1瓶    0.5ml×1瓶    2-8℃保存
陽性對照    0.5ml×1瓶    0.5ml×1瓶    2-8℃保存
酶標試劑    3ml×1瓶    6ml×1瓶    2-8℃保存
樣品稀釋液    3ml×1瓶    6ml×1瓶    2-8℃保存
顯色劑A液    3ml×1瓶    6ml×1瓶    2-8℃保存
顯色劑B液    3ml×1瓶    6ml×1瓶    2-8℃保存
終止液    3ml×1瓶    6ml×1瓶    2-8℃保存
濃縮洗滌液    （20ml×20倍）×1瓶    （20ml×30倍）×1瓶    2-8℃保存

樣本處理及要求：
1.血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清，保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應再次離心。
2.血漿：應根據(jù)標本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應該再次離心。
3.尿液：用無菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。
4.細胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。檢測細胞內(nèi)的成份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞濃度達到100萬/ml左右。通過反復凍融，以使細胞破壞并放出細胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。
5.組織標本：切割標本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。標本融化后仍然保?-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。
6.標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融.
7.不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。

操作步驟：
1.編號：將樣品對應微孔按序編號，每板應設陰性對照2孔、陽性對照2孔、空白對照1孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）
2.加樣：分別在陰、陽性對照孔中加入陰性對照、陽性對照50μl。然后在待測樣品孔先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，
3.溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。
4.配液：將30（48T的20倍）倍濃縮洗滌液加蒸餾水至600ml后備用
5.洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。
6.加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。
7.溫育：操作同3。
8.洗滌：操作同5。
9.顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘
10.終止：每孔加終止液50μl，終止反應（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。
11.測定：以空白空調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。測定應在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行。

結(jié)果判定：
試驗有效性：陽性對照孔平均值≥1.00;陰性對照平均值≤0.10
臨界值（CUTOFF）計算：臨界值=陰性對照孔平均值+0.15
陰性判定：樣品OD值<臨界值（CUTOFF）者為人抗呼吸道合胞病毒抗體(RSV)陰性
陽性判定：樣品OD值≥臨界值（CUTOFF）者為人抗呼吸道合胞病毒抗體(RSV)陽性

注意事項
1．操作嚴格按照說明書進行，本試劑不同批號組分不得混用。
2．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未用完，板條應裝入密封袋中保存。
3．濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結(jié)果。
4．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
5．底物請避光保存。
6．試驗結(jié)果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準，使用雙波長檢測時，參考波長為630nm
7．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。終止液為2M的硫酸，使用時必須注意安全。

保存條件及有效期
1．試劑盒保存：2-8℃。
2．有效期：6個月