Trizol法提取RNA原理以及詳細(xì)步驟

Trizol試劑的主要成分是苯/酚。苯/酚的主要作用是對細(xì)胞進(jìn)行裂解，從而使細(xì)胞當(dāng)中的蛋白質(zhì)以及核酸物質(zhì)解聚而得以釋放。苯/酚雖然可以有效的使蛋白質(zhì)變性，但它不能完全抑制RNA酶的活性，因此Trizol中還加入了8－羥基喹/啉、異硫氰酸胍、β-巰基乙醇等來抑制內(nèi)源和外源RNase（即RNA酶）。

Trizol試劑是直接從細(xì)胞或組織中提取總RNA的試劑。在樣品的裂解液或勻漿中，Trizol能保持RNA的完整性。加入氯/仿(CHCl3)后離心，樣品能分成水樣層和有機(jī)層。而RNA存在于水樣層中。在收集上面的水樣層后，RNA可以通過異丙醇沉淀的方法來還原。在除去水樣層之后，樣品中的核酸和蛋白也能相繼以沉淀的形式還原。乙醇沉淀能析出中間層的DNA，在有機(jī)層中加入異丙醇能析出有機(jī)層的蛋白。

Trizol試劑不但可用于小量樣品（組織：50-100mg；細(xì)胞：5×106），也可用于大量樣品（組織≥1g或細(xì)胞≥107），對動物、植物、細(xì)菌、血液提取都適用，可同時處理大量不同樣品。反應(yīng)迅速，提取的總RNA沒有DNA和蛋白質(zhì)污染，可用于Northernblot、RT-PCR、RNase保護(hù)分析等。
TRIZOL提取RNA步驟

1、在提取組織RNA時，每50～100mg組織用1ml Trizol試劑對組織進(jìn)行裂解；提取細(xì)胞RNA時，先離心沉淀細(xì)胞，每5-10╳106個細(xì)胞加1ml Trizol后，反復(fù)用槍吹打或劇烈振蕩以裂解細(xì)胞。

2、將組織或細(xì)胞的Trizol裂解液轉(zhuǎn)入EP管中,在室溫15~30C下放置5分鐘；在EP管中，按照每1mlTRIZOL加0.2ml氯仿的量加入氯仿，蓋上EP管蓋子，在手中用力震蕩15秒，在室溫下（15℃～30℃）放置2～3分鐘后，12000g（2℃～8℃）離心15分鐘。

3、取上層水相置于新EP管中,按照每1mlTRIZOL加0.5ml異丙醇的量加入異丙醇，在室溫下（15℃～30℃）放置10分鐘,12000g（2℃～8℃）離心10分鐘。

4、按照每1mlTRIZOL加1ml 75%乙醇進(jìn)行洗滌，渦旋混合，7500g（2℃～8℃）離心5分鐘，棄上清；讓沉淀的RNA在室溫下自然干燥；用Rnase-freewater溶解RNA沉淀。

Ps:在收集到生物材料之后，最好馬上進(jìn)行RNA制備工作。若需暫時儲存，則應(yīng)以液氮將生物材料急速冷凍后，儲存于-80℃冷凍柜。在制備RNA時，將儲存于冷凍柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式打破細(xì)胞，不可以先行解凍，以避免RNase的作用。