凝膠過濾分離效果不理想的因素

影響凝膠過濾分離效果的因素

(1)層析柱的選擇

層析柱大小主要是根據(jù)樣品量的多少以及對(duì)分辨率的要求來進(jìn)行選擇。一般來講，主要是層析柱的長(zhǎng)度對(duì)分辨率影響較大，長(zhǎng)的層析柱分辨率要比短的高；但層析柱長(zhǎng)度不能過長(zhǎng)，否則會(huì)引起柱子不均一、流速過慢等實(shí)驗(yàn)上的一些困難。一般柱長(zhǎng)度不超過100cm，為得到高分辨率，可以將柱子串聯(lián)使用。層析柱的直徑和長(zhǎng)度比一般在1:25－1:100之間。用于分組分離的凝膠柱，如脫鹽柱由于對(duì)分辨率要求較低，所以一般比較短。

(2)凝膠柱的鑒定

凝膠柱的填裝情況將直接影響分離效果，關(guān)于填裝的方法前面已有介紹，這里主要介紹對(duì)填裝好的凝膠柱的鑒定。凝膠柱填裝后用肉眼觀察應(yīng)均勻、無紋路、無氣泡。另外通?？梢圆捎靡环N有色的物質(zhì)，如藍(lán)色葡聚糖-2000、血紅蛋白等上柱，觀察有色區(qū)帶在柱中的洗脫行為以檢測(cè)凝膠柱的均勻程度。如果色帶狹窄、平整、均勻下降，則表明柱中的凝膠填裝情況較好，可以使用；如果色帶彌散、歪曲，則需重新裝柱。另外值得一提的是，有時(shí)為了防止新凝膠柱對(duì)樣品的吸附，可以用一些物質(zhì)預(yù)先過柱，以消除吸附。

(3)洗脫液的選擇

由于凝膠層析的分離原理是分子篩作用，它不象其它層析分離方式主要依賴于溶劑強(qiáng)度和選擇性的改變來進(jìn)行分離，在凝膠層析中流動(dòng)相只是起運(yùn)載工具的作用，一般不依賴于流動(dòng)相性質(zhì)和組成的改變來提高分辨率，改變洗脫液的主要目的是為了消除組分與固定相的吸附等相互作用，所以和其它層析方法相比，凝膠層析洗脫液的選擇不那么嚴(yán)格。由于凝膠層析的分離機(jī)理簡(jiǎn)單以及凝膠穩(wěn)定工作的pH 范圍較廣，所以洗脫液的選擇主要取決于待分離樣品，一般來說只要能溶解被洗脫物質(zhì)并不使其變性的緩沖液都可以用于凝膠層析。為了防止凝膠可能有吸附作用，一般洗脫液都含有一定濃度的鹽。

(4)加樣量

關(guān)于加樣前面已經(jīng)有所介紹，要盡量快速、均勻。另外加樣量對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也可能造成較大的影響，加樣過多，會(huì)造成洗脫峰的重疊，影響分離效果；加樣過少，提純后各組分量少、濃度較低，實(shí)驗(yàn)效率低。加樣量的多少要根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)要求而定：凝膠柱較大，當(dāng)然加樣量就可以較大；樣品中各組分分子量差異較大，加樣量也可以較大；一般分級(jí)分離時(shí)加樣體積約為凝膠柱床體積的1％－5％左右，而分組分離時(shí)加樣體積可以較大，一般約為凝膠柱床體積的10％－25％。如果有條件可以首先以較小的加樣量先進(jìn)行一次分析，根據(jù)洗脫峰的情況來選擇合適的加樣量。設(shè)要分離的兩個(gè)組分的洗脫體積分別為Ve1和Ve2，那么加樣量不能超過(Ve1－Ve2)。實(shí)際由于樣品擴(kuò)散，所以加樣量應(yīng)小于這個(gè)值。

從洗脫峰上看，如果所要的各個(gè)組分的洗脫峰分得很開，為了提高效率，可以適當(dāng)增加加樣量；如果各個(gè)組分的洗脫峰只是剛好分開或沒有完全分開，則不能再加大加樣量，甚至要減小加樣量。另外加樣前要注意，樣品中的不溶物必須在上樣前去掉，以免污染凝膠柱。樣品的粘度不能過大，否則會(huì)影響分離效果。

(5)洗脫速度

洗脫速度也會(huì)影響凝膠層析的分離效果，一般洗脫速度要恒定而且合適。保持洗脫速度恒定通常有兩種方法，一種是使用恒流泵，另一種是恒壓重力洗脫。洗脫速度取決于很多因素，包括柱長(zhǎng)、凝膠種類、顆粒大小等，一般來講，洗脫速度慢一些樣品可以與凝膠基質(zhì)充分平衡，分離效果好。但洗脫速度過慢會(huì)造成樣品擴(kuò)散加劇、區(qū)帶變寬，反而會(huì)降低分辨率，而且實(shí)驗(yàn)時(shí)間會(huì)大大延長(zhǎng)；所以實(shí)驗(yàn)中應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況來選擇合適的洗脫速度，可以通過進(jìn)行預(yù)備實(shí)驗(yàn)來選擇洗脫速度。一般凝膠的流速是2－10 cm/hr，市售的凝膠一般會(huì)提供一個(gè)建議流速，可供參考。總之，凝膠層析的各種條件，包括凝膠類型、層析柱大小、洗脫液、上樣量、洗脫速度等等，都要根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)要求來選擇。例如樣品中各個(gè)組分差異較小，則實(shí)驗(yàn)要求凝膠層析要有較高的分辨率，提高分辨率的選擇應(yīng)主要包括：選擇包括各個(gè)待分離組分但分離范圍盡量小一些的凝膠，選擇顆粒小的凝膠，選擇分辨率高的凝膠類型，選擇較長(zhǎng)、直徑較大的層析柱、減少加樣量、降低洗脫速度等等。