瓊脂糖凝膠電泳實驗原理與適用范圍

瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA原理

瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA實驗原理瓊脂糖凝膠電泳是分離、純化、鑒定DNA片段的典型方法，其特點為簡便、快速。

DNA片段瓊脂糖凝膠電泳的原理與蛋白質(zhì)的電泳原理基本相同，DNA分子在高于其等電點的pH溶液中帶負(fù)電荷，在電場中向正極移動。DNA分子在電場中通過介質(zhì)而泳動，除電荷效應(yīng)外，凝膠介質(zhì)還有分子篩效應(yīng)，與分子大小及構(gòu)想有關(guān)。

對于線形DNA分子，其電場中的遷移率與其分子量的對數(shù)值成反比。核酸分子是兩性解離分子，pH3.5是堿基上的氨基解離，而三個磷酸基團中只有一個磷酸解離，所以分子帶正電，在電場中向負(fù)極泳動；而pH8.0-8.3時，堿基幾乎不解離，而磷酸基團解離，所以核酸分子帶負(fù)電，在電場中向正極泳動。
瓊脂糖凝膠電泳的適用范圍

瓊脂糖凝膠電泳是用于分離、鑒定和提純DNA片段的標(biāo)準(zhǔn)方法。瓊脂糖是從瓊脂中提取的一種多糖，具親水性，但不帶電荷，是一種很好的電泳支持物。DNA在堿性條件下（pH8.0的緩沖液）帶負(fù)電荷，在電場中通過凝膠介質(zhì)向正極移動，不同DNA分子片段由于分子和構(gòu)型不同，在電場中的泳動速率液不同。溴化乙錠（EB）可嵌入DNA分子堿基對間形成熒光絡(luò)合物，經(jīng)紫外線照射后，可分出不同的區(qū)帶，達(dá)到分離、鑒定分子量，篩選重組子的目的。

（按0.3-1.5%的瓊脂糖含量，1-25kb大小的DNA用1%的凝膠，20-100kb的DNA用0.5%的凝膠，200-2000bp的DNA用1.5%的凝膠）

瓊脂糖凝膠電泳實驗需注意以下幾點：

1.體系配制時候最關(guān)鍵的幾個試劑一定要確定它們還有效、或者還沒被污染：引物，酶，超純水。這些東西最好自己收好，寫上個人的名字放好，冰盒上記得帶上橡皮筋，這樣就不會因為別人翻冰箱時候把你的冰盒碰散了，試劑都碰掉。否則，你的試劑被污染了，到時候陰性對照狂出條帶，再去找污染源很麻煩。而且配置體系時候要注意保持實驗區(qū)的干凈，事先可用小噴壺進(jìn)行酒精噴霧，固定空氣中的DNA，而且全程要戴手套，避免污染體系。

2.pcr體系要摸準(zhǔn)，最好用人家都做得很多的老體系來上手。

3.要想得到漂亮的電泳圖，可以在PCR開始時候就把膠倒上（前提是你的PCR總時間在1.5小時左右，并且1.5小時候之后你還在實驗室。），讓凝膠涼著，這樣凝膠的上樣孔會比較規(guī)則，膠體里面的其本身的孔徑也會較規(guī)則。如果你要第二天再跑膠，千萬記得把PCR完畢的樣本放入4℃保存。第二天做時候建議把膠涼上25分鐘左右。

4.瓊脂糖凝膠電泳上樣時候建議使用排槍上樣，不僅快速而且樣本加到膠孔里的速度一致。當(dāng)然，排槍上樣最好選用進(jìn)口槍頭。

5.不管電泳室使用的頻率高還是低，我都建議每次瓊脂糖凝膠電泳時候更換電泳液，避免出現(xiàn)“＾”形條帶。