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細胞融合方法以及融合過程介紹

2024-05-29 10:13 來源:上海遠慕生物試劑
細胞融合的方法很多,常用的有轉動法和離心法。融合時脾細胞和骨髓瘤細胞的比例為1:1至10:1不等。3:1或5:1最為常用。
細胞融合的方法很多,常用的有轉動法和離心法。融合時脾細胞和骨髓瘤細胞的比例為1:1至10:1不等。3:1或5:1最為常用。


1.試劑與材料

(1)供融合用的脾細胞及骨髓瘤細胞。

(2)1640培養(yǎng)液100ml。

(3)完全1640液100ml。

(4)2.5%FCS-1640液50ml。

(5)HAT培養(yǎng)液100ml。

(6)50%PEG:取分子量4000,高純度的(日本進口或Serva)PEG10g放入25ml瓶中高壓滅菌,使用前用預熱于40℃的1640液10ml等量(W/V)混合,以酚紅檢查pH,一般不必調pH。如pH有改變,可用HCl或NaHCO3調整。

(7)10ml和50ml的滅菌沉淀管或瓶。

(8)40孔塑料培養(yǎng)盤。

2.操作方法

⑴準備好脾細胞。

⑵在50ml沉淀管中混合108脾細胞和107小鼠骨髓瘤細胞,并加入50ml2.5%FCS-1640液。

⑶室溫400g離心3min,使細胞沉淀。

⑷移去上清液。

⑸輕敲管底部,使沉淀流動,把沉淀管放于40℃水浴中,使其達融合溫度。

⑹加預熱至40℃的50%PEG0.8ml,用1ml吸管緩慢滴加,邊加邊搖沉淀管,肉眼觀察可見有顆粒出現(xiàn),滴加過程要求持續(xù)2min。

⑺加1ml1640液,邊加邊搖動,持續(xù)1min。

⑻重復⑺一次。

⑼加1ml1640液,邊加邊搖動,持續(xù)0.5min。

⑽重復⑼一次。

⑾加1640液15ml。

⑿室溫,400g離心1min,使細胞沉淀。

⒀去上清,輕敲管底部,加25ml含有HAT的完全1640液。

⒁往已于前一日種有飼養(yǎng)細胞的40孔塑料培養(yǎng)盤中滴加融合的細胞液,每孔1滴(約0.05ml)。

⒂輕搖后,放入5%CO2飽和濕度的37℃溫箱中培育。

⒃第3、6、9、10日換入含HAT的完全1640培養(yǎng)液。注意輕輕吸取上清液,勿將固定于孔底的細胞吸出,根據(jù)需要加入適量的飼養(yǎng)細胞。

⒄于第12、15日加入含有HAT的完全1640培養(yǎng)液。在每次換液前用倒置顯微鏡觀察,大約在10天左右就可觀察到雜交瘤細胞生長出來。大多數(shù)雜交瘤細胞在10~20天內出現(xiàn),但也有在1個月左右才能出現(xiàn)的。雜交瘤細胞出現(xiàn)后,吸取上清液,檢查抗體。

⒅對繼續(xù)生長的雜交瘤細胞進行增殖傳代。在傳代過程中,依情況取消HAT液和完全1640液而代之以10%FCS-1640液。同時保存于液氮和進行克隆化,在這期間每代都要檢查抗體,以防止產(chǎn)生抗體細胞的變異和丟失。
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