慢病毒感染目的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)步驟

1. 感染預(yù)實(shí)驗(yàn)

以 24 孔培養(yǎng)板為例，同時(shí)進(jìn)行目的細(xì)胞和工具細(xì)胞的感染預(yù)實(shí)驗(yàn)。工具細(xì)胞可選擇 293T（人胚腎上皮細(xì)胞）、H1299（人肺癌細(xì)胞）或其它細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)材料：培養(yǎng)基、24 孔培養(yǎng)板，移液槍?zhuān)瑯岊^， EP 管，細(xì)胞計(jì)數(shù)板、冰盒、廢液缸等。（根據(jù)目的細(xì)胞情況，可酌情使用 Polybrene） Day1：

準(zhǔn)備細(xì)胞：培養(yǎng)細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞以胰酶消化計(jì)數(shù)后，用細(xì)胞計(jì)數(shù)測(cè)出細(xì)胞密度，每孔接種 5×104 個(gè)細(xì)胞，添加細(xì)胞培養(yǎng)液至 500μL。通常情況下，該接種量的 H1299 或 293T 細(xì)胞在感染后第 3 天可生長(zhǎng)至 80%-90% 融合度。（接種目的細(xì)胞時(shí)，請(qǐng)根據(jù)細(xì)胞的實(shí)際生長(zhǎng)速度調(diào)整接種量，使目的細(xì)胞感染后第 3 天生長(zhǎng)至 80%-90% 融合度）

Day2：

（1）準(zhǔn)備慢病毒顆粒：計(jì)算所需慢病毒顆粒的量，將凍存在 -80℃ 的慢病毒顆粒取出，冰浴融化；

（2）感染目的細(xì)胞：從培養(yǎng)箱中拿出細(xì)胞，置于顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)及細(xì)胞融合度；如細(xì)胞狀態(tài)較好，則開(kāi)始實(shí)驗(yàn)：

A. 用移液槍小心吸去 24 孔板中的舊培養(yǎng)液，加入新的完全培養(yǎng)液；

B. 在細(xì)胞中分別加入計(jì)算好的慢病毒顆粒液，將培養(yǎng)板平置于工作臺(tái)上，以劃 8 字的方式輕柔混勻；

C. 混勻后，細(xì)胞培養(yǎng)板置于 37℃、5% CO2 培養(yǎng)箱，過(guò)夜培養(yǎng)。

Day3：

更換培養(yǎng)液：感染 12-16 小時(shí)后，吸出含慢病毒顆粒的培養(yǎng)液，重新向培養(yǎng)板添加含 5% 滅活 FBS（胎牛血清）的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。（目的細(xì)胞需要調(diào)整感染時(shí)長(zhǎng)，部分細(xì)胞不可感染超過(guò) 12 小時(shí)。）

Day4：

繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，觀察細(xì)胞狀態(tài)是否有異常。

Day5：

觀察（評(píng)估）慢病毒顆粒感染效率：蓋緊 24 孔培養(yǎng)板，使用 70% 乙醇清理培養(yǎng)板外壁，在倒置熒光顯微鏡觀察熒光，拍照并估計(jì)慢病毒顆粒對(duì)細(xì)胞的感染效率。（如果慢病毒顆粒攜帶的基因表達(dá)所需的時(shí)間較長(zhǎng)，熒光表達(dá)所需時(shí)間也較長(zhǎng)，建議感染 72、96 小時(shí)后觀測(cè)熒光表達(dá)。）

根據(jù)熒光情況，可以初步從 MOI 梯度摸索實(shí)驗(yàn)中，找出目的細(xì)胞的 MOI 值。