細(xì)胞凍存原理+操作步驟+注意事項(xiàng)

　　凍存原理
　　
　　當(dāng)細(xì)胞所處溫度低于0°C時(shí)，細(xì)胞脫水，細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶，冰晶的大小對細(xì)胞的影響是不同的，大冰晶容易造成細(xì)胞膜、細(xì)胞器的損傷和破裂，故造成復(fù)蘇出來的細(xì)胞存活率、狀態(tài)等與凍存前的狀態(tài)相差甚遠(yuǎn)。因此，我們在凍存細(xì)胞的時(shí)候會(huì)采取兩個(gè)措施，一加入低溫保護(hù)劑，二，慢凍細(xì)胞。
　　
　　凍存時(shí)機(jī)：細(xì)胞應(yīng)在生長良好、密度約為 80-90％、數(shù)目一般為 10 6 -10 7 /ml，活力差的細(xì)胞在凍存后的成活率很小。
　　
　　低溫保護(hù)劑：常用的低溫保護(hù)劑是二甲基亞砜DMSO，它是一種滲透保護(hù)劑，可迅速透入細(xì)胞，提高細(xì)胞膜對水的通透性，降低冰點(diǎn)，延緩凍結(jié)過程，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對細(xì)胞的損傷。
　　
　　慢凍細(xì)胞：可以使用程序性降溫盒，緩慢凍存細(xì)胞，可使細(xì)胞內(nèi)避免產(chǎn)生大的冰晶。如果沒有程序降溫盒，可以將凍存細(xì)胞依次放于4度1h，-20度2h，-80過夜，大部分細(xì)胞也可以適應(yīng)。
　　
　　凍存液配置：凍存液應(yīng)該提前配制，置于室溫備用，防止臨時(shí)配制產(chǎn)生的熱量損傷細(xì)胞（DMSO加入到培養(yǎng)基中會(huì)放熱），凍存液常規(guī)配比為培養(yǎng)基：血清：DMSO=7:2:1，如果細(xì)胞比較珍貴，可以調(diào)整為血清：DMSO=9:1。
　　
　　操作步驟：
　　
　　1.用移液器吸走原培養(yǎng)基，加入適量PBS洗1-2遍；
　　
　　2.消化細(xì)胞：加入適量胰酶，置于培養(yǎng)箱中37°C消化（10厘米大皿中加入1ml 0.25%的胰酶，消化4-5min，注意不同細(xì)胞消化時(shí)間不同，終止消化截點(diǎn)為鏡下觀察80%-90%以上的細(xì)胞變圓）；
　　
　　3.待消化到位后加入胰酶2倍體積的完全培養(yǎng)基終止消化，800-1000rpm離心3-5min；
　　
　　4.準(zhǔn)備好凍存管，標(biāo)記上日期，細(xì)胞類別，人名，代數(shù)，待細(xì)胞離心后去上清，加入凍存液重懸，每管1-1.5ml,轉(zhuǎn)移到凍存管中；
　　
　　5.將凍存管放入程序降溫盒中，-80度過夜，然后轉(zhuǎn)移到液氮中保存。
　　
　　注意事項(xiàng)
　　
　　1、  細(xì)胞加入凍存液之后立即放入-80度保存，勿常溫放置太久
　　
　　2、 凍存細(xì)胞儲(chǔ)存在-80度中通常不建議超過半年，液氮中通常不建議超過2年。