“跑膠”實(shí)驗(yàn)也可以很簡(jiǎn)單~

“跑膠”看到這個(gè)，已經(jīng)進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室學(xué)習(xí)的小伙伴想必不陌生，瓊脂糖凝膠制作膠板從而讓樣品在膠板上產(chǎn)生電泳，簡(jiǎn)稱(chēng)“跑膠”。通常跑膠分為跑瓊脂糖膠和 SDS-PAGE 膠，當(dāng)然也還有非變性膠，這里主要說(shuō)明上面兩種。

SDS-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE 膠）

一、原理

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，其中 SDS 能斷裂分子內(nèi)和分子間氫鍵，破壞蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，強(qiáng)還原劑能使半胱氨酸之間的二硫鍵斷裂，蛋白質(zhì)在一定濃度的含有強(qiáng)還原劑的 SDS 溶液中，與 SDS 分子按比例結(jié)合，形成帶負(fù)電荷的 SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，這種復(fù)合物會(huì)使蛋白質(zhì)喪失了原有的電荷狀態(tài)形成僅保持原有分子大小為特征的負(fù)離子團(tuán)塊。

從而降低或消除了各種蛋白質(zhì)分子之間天然的電荷差異，由于 SDS 與蛋白質(zhì)的結(jié)合是按重量成比例的，因此在進(jìn)行電泳時(shí)，蛋白質(zhì)分子的遷移速度取決于分子大小。

SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳的有效分離范圍取決于膠的聚丙烯酰胺的濃度與交聯(lián)度。

各種需要用到的溶液配方

考馬斯亮藍(lán)染液

在 90 ml 甲醇：水（體積比 1:1）和 10 ml 冰乙酸混合液中溶解 0.25 g 考馬斯亮藍(lán) R-250。用 0.45/0.22um 的膜抽濾，室溫保存。

脫色液

在 90 ml 甲醇：水（體積比 1:1）和 10 ml 冰乙酸混合液用 0.45/0.22um 的膜抽濾，室溫保存。

1X Tris-甘氨酸電泳緩沖液 （即 Running buffer）25 mmol/L Tris

250 mmol/L 甘氨酸

0.1%（m/V）SDS

同樣可以擴(kuò)大配方為 5X 的儲(chǔ)存液。

30％ 丙烯酰胺混合液（100 ml）

29.2 g 丙烯酰胺（Acr）

0.8 g 亞甲基雙丙烯酰胺（Bis）

10 g SDS 外包錫紙，4℃ 冰箱保存

二、制膠

選擇膠板（0.75 mm 或 0.1 mm 的，上樣量會(huì)有些差別，新手的話推薦 0.1 mm）制膠前先將膠板刷干凈，裝上以后用水先驗(yàn)漏（5-10 min）然后倒掉水且從側(cè)邊將水用濾紙吸干。

根據(jù)你的蛋白大小來(lái)選擇一定濃度的膠。

注意最后加入 TEMED（N,N,N’,N’-四甲基乙二胺）（因?yàn)?TEMED 能夠通過(guò)催化過(guò)硫酸銨形成自由基而加速丙烯酰胺的聚合）先配下層膠每塊膠 5 ml，加到固定架子的夾子處即可（圖中紫色線所在的位置），然后用加水將膠壓平。

等待膠干（通過(guò)未加完的液來(lái)判斷）然后是上層的積層膠，先將上層水倒出吸干，再將積層膠加入，立即在其中插入一塊干凈的梳子，注意不要混入氣泡，然后在家一些積層膠溶液徹底填滿梳子之間的空隙，將膠垂直放置等待膠凝固。

每塊膠需配 1 ml，新手可配 2 ml，以防插梳齒時(shí)不順，還可以有補(bǔ)救的機(jī)會(huì)，同樣注意最后加入 TEMED，最后將液用槍均勻打入即可，待干了后即使用。

樣品處理

e.g. 6XSDS-PAGE 上樣緩沖 4 ul+蛋白液 20 ul 與小 EP 管中，將其放入沸水中 5 mln，再 8 000 r 離心 5 min。若有多余的孔道可以用上樣緩沖+水的混合物來(lái)填充。

裝好跑膠裝置

將膠專(zhuān)門(mén)的夾子夾住注意一定兩面均要夾上且?jiàn)A緊，將整個(gè)膠架放入電泳槽中，先加入 running buffer 電泳槽至夾腳上方一點(diǎn)即可，再向膠中加入 running buffer。不要急于加樣，可以緩個(gè)幾分鐘看看是否漏液，漏的話需要重新用夾子固定膠。若不漏液，小心地將梳子拔下。

三、上樣

上樣盡量選槍頭細(xì)的槍?zhuān)琺aker 最多上 10ul（條帶就很深了），上蛋白樣 10-20ul 均可（但其他孔道一定要保持一致，這樣才能保證各個(gè)孔道的條帶的平整），多出來(lái)的孔道要用上樣緩沖稀釋液來(lái)填充，不然最邊上的條帶會(huì)跑的歪向一邊，條帶會(huì)很丑。

跑膠

電壓一般設(shè)置 110 V，其他也是可以的，一般 85～150 V 都問(wèn)題不大，電壓太大速度快但會(huì)產(chǎn)熱大，電壓太小速度太慢。根據(jù)所跑的目的蛋白的大小來(lái)定時(shí)間，若蛋白大小超過(guò) 100 kDa，可以讓藍(lán)色上樣緩沖跑出來(lái)后，再跑上 20 min；若蛋白的大小小于 15 kDa，則使藍(lán)色到整塊膠 4/5 處就可以停止了；若蛋白大小介于 15-100 kDa 之間，則使藍(lán)色到膠的末尾即可。這樣的目的是跑出來(lái)的目的條帶盡可能的處于相對(duì)中間的位置。

四、拍照

有些上樣緩沖中會(huì)加有免染的染料，就可以直接通過(guò)凝膠成像儀來(lái)直接成像。對(duì)于一般的情況還是要通過(guò)考染（將凝膠浸泡在至少 5 倍體積的染色液中，置平緩搖動(dòng)的平臺(tái)上溫室染色至少 4 小時(shí)），在用脫色液褪色（同樣也要在水平的混勻儀器上搖）后在用凝膠成像儀來(lái)看即可。

瓊脂糖凝膠電泳

一、原理

瓊脂糖是 D-和 L-半乳糖殘基通過(guò)糖苷鍵交替構(gòu)成的線狀聚合物，且瓊脂糖凝膠具有三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，物質(zhì)分子通過(guò)時(shí)會(huì)受到阻力，不同的大小的帶電物質(zhì)在電場(chǎng)下涌動(dòng)時(shí)受到的阻力不同，因此在凝膠電泳中，帶電顆粒的分離不僅取決于凈電荷的性質(zhì)和數(shù)量，而且還取決于分子大小，這就大大提高了分辨能力。

一般用于分離核酸分子，同時(shí)不同構(gòu)象的核酸的遷移速率也不一樣，超螺旋環(huán)狀＞切口環(huán)狀＞線狀。不同濃度的膠適用的分離范圍也不一樣。

二、制膠

這里以 1% 瓊脂糖膠為例

緩沖 TBE：Tris-硼酸（TBE）

使用液

0.5X：0.045mol/L Tris-硼酸

0.001mol/L EDTA（pH8.0）

儲(chǔ)存液（1 000 ml）

5X：54 g Tris 堿

27.5 g 硼酸

20 ml 0.5mol/L EDTA（pH8.0）

TBE 盡量用 5X 儲(chǔ)存，10X 的比較容易沉淀。

染料：溴化乙錠或 SYBR GOLD

制膠的第一步是選好梳齒，將膠架放上膠板，再放上梳齒。梳齒決定了膠的孔道的大小，盡量選擇厚的梳齒，梳齒的間距較大的，這樣一來(lái)既可以增加上樣量又能避免上樣時(shí)槍頭不小心破壞了膠孔。

第二步是取稀釋成 0.5X 的 TBE 25 ml，1000X 染料 2.5ul（根據(jù)具體染料的乘數(shù)來(lái)定），0.25 g 的瓊脂糖，放入在厚玻璃瓶中，用微波爐對(duì)其加熱至液體中沒(méi)有顆粒。

第三步是趁熱加到膠架上，調(diào)整梳齒（不要使梳齒靠到兩邊，不然挨著的孔會(huì)不能用了），趕氣泡（用槍頭將氣泡趕到邊緣，不然凝固的膠中有氣泡若在孔道中將會(huì)影響到樣的電泳速度，得到的條帶會(huì)不平整）。

三、上樣

待膠凝固好了，將膠架取下來(lái)放到電泳槽中，（若有多余的孔道可以切下來(lái)放入一次性手套中在 4 度保存），用 0.5XTBE 覆蓋膠。

然后上樣 Maker（根據(jù)你的樣的大小來(lái)定）最多 10 ul（如果你的樣的上樣量少可以酌情減少，這樣之后跑完膠照相是條帶的相對(duì)亮度會(huì)更好）；

樣（處理，用 loading buffer，根據(jù) buf 的乘數(shù)來(lái)定）最多 20 ul 就足夠了。將膠擺正，蓋上蓋接上電源后（注意膠的擺放一定是向正極跑，不然你的樣都跑出去了，你就苦逼了）。

調(diào)好電壓和時(shí)間，一般為 110 V，不同的 DNA 大小不同時(shí)間也不太一樣，但原則上使 maker 跑到膠的 2/3 處就可以了。

四、拍照

用凝膠成像儀，調(diào)整好曝光度，保存條帶亮度差不多的即可。