人肝素輔因子Ⅱ(HCⅡ)ELISA試劑盒使用說明書

人肝素輔因子Ⅱ(HCⅡ)ELISA試劑盒使用說明書

本試劑盒運用雙抗體夾心ELISA法定量測定人血清、血漿、組織勻漿、細(xì)胞裂解液、細(xì)胞培養(yǎng)上清液和其他生物液體中人肝素輔因子Ⅱ(HCⅡ)含量。

檢測范圍
0.156-10ng/mL此檢測范圍僅供參考,可根據(jù)您的要求定做.
最低檢測限 0.067ng/mL

實驗原理
本酶聯(lián)免疫吸附測定ELISA試劑盒運用采用雙抗體夾心ELISA法。用抗人肝素輔因子Ⅱ(HCⅡ)抗體包被于酶標(biāo)板上，實驗時樣品或標(biāo)準(zhǔn)品中的人肝素輔因子Ⅱ(HCⅡ)與包被抗體結(jié)合，游離的成分被洗去。依次加入生物素化的抗人肝素輔因子Ⅱ(HCⅡ)抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和素?？谷烁嗡剌o因子Ⅱ(HCⅡ)抗體與結(jié)合在包被抗體上的人肝素輔因子Ⅱ(HCⅡ)結(jié)合、生物素與親和素特異性結(jié)合而形成免疫復(fù)合物，游離的成分被洗去。加入顯色底物(TMB)，TMB在辣根過氧化物酶的催化下呈現(xiàn)藍(lán)色，加終止液后變成黃色。用酶標(biāo)儀在450nm波長處測OD值，人肝素輔因子Ⅱ(HCⅡ)濃度與OD450值之間呈正比，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣品中人肝素輔因子Ⅱ(HCⅡ)的濃度。具體參照各指標(biāo)試劑盒相應(yīng)的使用說明書。

試劑盒內(nèi)容
試劑名稱    數(shù)量    試劑名稱    數(shù)量
96孔板(預(yù)包被)    1    96孔板覆膜    2
標(biāo)準(zhǔn)品    0.5ml×1    標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液    1.5ml×1瓶
顯色劑A液    6ml×1瓶    樣品稀釋液    6ml×1瓶
顯色劑B液    6ml×1瓶    終止液    6ml×1瓶
酶標(biāo)試劑    6ml×1瓶    密封袋    1
濃洗滌液(30×)    1×20mL    使用說明書    1

人肝素輔因子Ⅱ(HCⅡ)ELISA試劑盒需自備的設(shè)備及試劑
1. 450±10nm濾光片的酶標(biāo)儀(建議儀器使用前提前預(yù)熱)
2. 單道或多道微量加液器及吸頭
3. 稀釋樣品的EP管
4. 蒸餾水或去離子水
5. 吸水紙
6. 盛放洗液的容器

試劑盒的儲存及有效期
1. 未開封的試劑盒：所有試劑均按試劑瓶標(biāo)簽上所示保存。請注意，收到試劑盒后請盡快將TMB 洗滌液，終止液保存于4℃，其他試劑保存于-20℃。
2. 使用后的試劑盒：剩余試劑仍需按照試劑瓶標(biāo)簽所示的溫度保存，開封后的酶標(biāo)板要加干燥劑后密封保存于-20℃，避免潮濕。

注意：
試劑盒內(nèi)酶標(biāo)條可拆卸，按實驗需求可分多次使用；使用后的剩余試劑盒建議在首次實驗后 1個月內(nèi)使用完畢。產(chǎn)品過期時間以盒子上的標(biāo)簽為準(zhǔn)，保質(zhì)期內(nèi)所有組分都確保是穩(wěn)定的。

試劑盒標(biāo)本的采集與保存
1. 血清：
將收集于血清分離管的全血標(biāo)本在室溫放置 2 小時或 4oC 過夜，然后 1000×g 離心 20 分鐘，取上清即可，或?qū)⑸锨逯糜?20oC 或-80oC 保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
2. 血漿：
用 EDTA 或肝素作為抗凝劑采集標(biāo)本，并將標(biāo)本在采集后的 30 分鐘內(nèi)于 2-8oC 1000×g 離心 15 分鐘，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?20oC或-80oC 保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
3. 組織勻漿：
1） 取適量組織塊，于預(yù)冷PBS（0.01mol/L, pH 7.0-7.2）中清洗去除血液，稱重后備用（組織塊較大需先剪碎后再勻漿）；
2） 可同時選用多種勻漿方法達(dá)到較好的破碎效果：首先將組織塊移入玻璃勻漿器，加入5-10mL 預(yù)冷PBS 進(jìn)行充分研磨，該過程需在冰上進(jìn)行（有條件實驗室可選用機(jī)器勻漿）；得到的勻漿液可再利用超聲破碎或反復(fù)凍融 進(jìn)一步處理（超聲破碎過程中注意冰浴降溫；反復(fù)凍融法可重復(fù)2次）。
3） 將制備好的勻漿液于5000×g 離心5 分鐘，留取上清即可檢測。
4. 細(xì)胞裂解液：
1）貼壁細(xì)胞需要先用胰酶消化，離心收集細(xì)胞（懸浮細(xì)胞可直接離心收集）；
2）將收集到的細(xì)胞用冷PBS 洗3 次；
3）物理方法裂解細(xì)胞（可先超聲破碎細(xì)胞，再反復(fù)凍融）：
i 超聲破碎：取適量PBS 重懸細(xì)胞，用一定功率的超聲波處理細(xì)胞懸液，使細(xì)胞急劇震蕩破裂。
ii 反復(fù)凍融：將待破碎的細(xì)胞在-20 oC 以下冰凍，室溫融解，反復(fù)3 次，使細(xì)胞溶脹破碎。
4）將標(biāo)本于2-8 oC 1500×g 離心10 分鐘，收集上清備用。
5. 細(xì)胞培養(yǎng)上清或其它生物標(biāo)本：
請 1000×g 離心 20 分鐘，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?20oC 或-80oC 保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

注意：
1. 以上標(biāo)本均需密封保存，4oC保存應(yīng)小于1周，-20oC不應(yīng)超過1個月，-80oC不應(yīng)超過2個月。
2. 標(biāo)本使用前應(yīng)緩慢均衡至室溫，不應(yīng)加熱使之融解。
3. 實驗前紅細(xì)胞裂解液必須用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液稀釋。

試劑準(zhǔn)備
1. 使用前將所有的試劑和標(biāo)本緩慢均衡至室溫(18-25oC)，試劑不能直接在37oC溶解。
2. 標(biāo)準(zhǔn)品(凍干品)：每瓶標(biāo)準(zhǔn)品加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液1mL，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時反復(fù)顛倒/搓動以助溶解，其濃度為10ng/mL。準(zhǔn)備7個稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的EP管，每個EP管中加入150μL的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，如圖依次倍比稀釋成不同的梯度，10ng/mL-5ng/mL-2.5ng/mL-1.25ng/mL-0.625ng/mL-0.3125ng/mL, 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液(0pg/mL)直接作為空白孔。為保證實驗結(jié)果有效性，每次實驗請使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。
3. 濃洗滌液：用580mL蒸餾水或去離子水將20mL濃洗滌液稀釋至600mL，進(jìn)行30倍稀釋。

標(biāo)本處理
1. 本公司只對試劑盒本身負(fù)責(zé)，不對因使用該試劑盒所造成的樣本消耗負(fù)責(zé)，請使用者使用前充分考慮到樣本的可能使用量，預(yù)留充足的樣本。
2. 實驗前應(yīng)預(yù)測標(biāo)本含量，如果標(biāo)本濃度過高，應(yīng)對標(biāo)本進(jìn)行稀釋，使稀釋后的標(biāo)本符合試劑盒的檢測范圍，計算時再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。
3. 若所檢樣本不包含在說明書所列樣本之中，建議進(jìn)行預(yù)實驗驗證其有效性，并注意留存樣本。