人髓鞘堿性蛋白抗體(MBP)ELISA試劑盒實驗步驟

人髓鞘堿性蛋白(MBP)ELISA試劑盒(用于血清、血漿、細胞培養(yǎng)上清液和生物體液內)

實驗原理
本實驗采用雙抗體夾心ABC-ELISA法。用抗人MBP單抗包被于酶標板上，標準品和樣品中的MBP與單抗結合，加入生物素化的抗人MBP，形成免疫復合物連接在板上，辣根過氧化物酶標記的Streptavidin與生物素結合，加入底物工作液顯藍色，最后加終止液硫酸，在450nm處測OD值，MBP濃度與OD值成正比，可通過繪制標準曲線求出標本中MBP濃度。

試劑盒組成（2-8℃保存）
酶標板（CoatedWells）    96孔    酶標抗體工作液（EnzymeConjugate）    12ml
10×標本稀釋液（SampleBuffer）    12ml    20×濃縮洗滌液（WashBuffer）    50ml
標準品（Standards）：200ng/瓶    2瓶    底物工作液（TMBSolution）    12ml
第一抗體工作液（BiotinylatedAntibody）    12ml    終止液（StopSolution）    12ml

準備試劑與收集血樣
1.收集標本：血清、血漿（EDTA、肝素抗凝）、細胞培養(yǎng)上清液、組織勻漿等盡早檢測，2-8℃保存48小時；更長時間須冷凍（-20℃或-70℃）保存，避免反復凍融。血清、血漿作1：2稀釋（取100ul，加標本稀釋液100ul,稀釋2倍）。細胞培養(yǎng)上清可以不做稀釋直接檢測。
2.標準品液配制：使用前加入1ml蒸餾水混勻，配成200ng/ml的溶液。設標準管8管，第一管加標本稀釋液900ul，第二至第八管加入標本稀釋液500ul。在第一管中加入200ng/ml的標準品溶液100ul混勻后用加樣器吸出500ul，移至第二管。如此反復作對倍稀釋，從第七管中吸出500ul棄去。第八管為空白對照。
3.10×標本稀釋液用蒸餾水作1:10倍稀釋（示例：1ml濃稀釋液+9ml蒸餾水）。
4.洗滌液：用重蒸水1:20稀釋（示例：1ml濃縮洗滌液加入19ml的重蒸水）

檢測程序
1.加樣：每孔各加入標準品或待測樣品100ul，將反應板充分混勻后置37℃120分鐘。
2.洗板：用洗滌液將反應板充分洗滌4-6次，向濾紙上印干。
3.每孔中加入第一抗體工作液100ul。將反應板充分混勻后置37℃60分鐘。
4.洗板：同前。
5.每孔加酶標抗體工作液100ul。將反應板置37℃30分鐘。
6.洗板：同前。
7.每孔加入底物工作液100ul，置37℃暗處反應15分鐘。
8.每孔加入100ul終止液混勻。
9.30分鐘內用酶標儀在450nm處測吸光值。

結果計算與判斷
1.所有OD值都應減除空白值后再行計算。
2.以標準品20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.312、0ng/ml為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上作圖，畫出標準曲線。
3.根據樣品OD值在該曲線圖上查出相應MBP含量，再乘上稀釋倍數即可。

試劑盒性能
1.靈敏度：最小的MBP檢測濃度小于0.16ng/ml。
2.特異性：可同時檢測重組或天然的人MBP。不與人其它細胞因子有交叉反應。
3.重復性：板內、板見變異系數均小于9.6％。

注意事項
1.以上標準孔及待測樣品均建議做復孔，每次測定應同時做標準曲線。
2.洗滌過程很關鍵。洗滌不充分將導致精確度誤差及OD值錯誤地升高。
3.板條開封后剩余板條要再封好，保持板條干燥。
4.本試劑盒宜置4oC冰箱保存。
5.本試劑盒僅用于科研，不能用于臨床診斷！